Применение методов молекулярного моделирования для разработки новых лекарств (1104483), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Дляэтих комплексов проведена оценка качества позиционирования программой SOL иопределено, что 80 % лигандов имеют среднеквадратичное отклонение от нативногоположения (RMSD) < 3Å. Также в подавляющем большинстве случаев в первыйкластер (кластер с минимальной энергией) попадает довольно большое числолигандов, что говорит о том, что глобальный минимум энергии связывания белоклиганд с большой вероятностью найден.Для расширенного набора комплексов урокиназа-лиганд, в который вошли нетолько нативные комплексы, но и комплексы урокиназы с соединениями, заведомо неявляющимися ее ингибиторами, проведена проверка качества оценки энергиисвязыванияпрограммойSOL.Количестволожноположительныхиложноотрицательных результатов после докинга 89 лигандов программой SOL, а такжекоэффициентыкорреляциирассчитанныхэнергийсэнергиямиполученными из экспериментальных данных, приведены в таблице 2.связывания,11Таблица 2.
Коэффициент корреляции рассчитанных значений энергий сэкспериментальными энергиями и число ложно положительных и ложноотрицательных результатов при докинге программой SOL для 89 комплексовурокиназа-лиганд.Коэффициент корреляции0.45(для 89 комплексов)Коэффициент корреляции0.35(для 45 нативных комплексов)Число ложноположительных28ВсегоЧисло ложноотрицательных533Помимо этого была проведена оценка способности программы SOLвыбирать активные соединения среди множества неактивных с помощьюпостроения кривой обогащения (зависимость количеств активных лигандов средипервых N выбранных лигандов от доли выбранных N лигандов среди всехлигандов) и вычисления коэффициента обогащения (площади под кривойобогащения).
Чем ближе коэффициент обогащения к единице, тем выше качествооценочной функции. Кривая обогащения для 1888 неактивных в отношенииурокиназы лигандов из базы данных Национального Института Рака, США, NCIDiversity и 7 активных ингибиторов урокиназы приведена на рисунке 1.Enrichment Plot1,210,80,60,40,2000,20,40,60,81Рис. 1. Кривая обогащения, построенная для программы докинга SOL на основе 7активных в отношении урокиназы и 1888 неактивных в отношении урокиназылигандов.
Коэффициент обогащения для этой кривой = 0.98.Значение коэффициента обогащения равно 0.98 и считается достаточновысоким, чтобы утверждать, что программа успешно находит активные соединенияво множестве неактивных.12Чтобы сравнить результаты сеточного докинга и прямого докинга также былипроведены вычисления с помощью программы FLM. С точки зрения качества докингаона показала неплохие результаты: для 43 нативных комплексов урокиназа-лиганд из45 удалось найти такое «задоченное» положение лиганда, которое имеет низкуюэнергию и отличается от нативного с RMSD < 2 Å.
Коэффициент корреляции приэтом составил 0.44. Однако поиск глобального минимума энергии в этом случаепотребовал большого времени вычислений - на порядок больше, чем программа SOL(более 20000 процессоро-часов), что делает невозможным на данном этапеприменение прямого докинга для задач, где требуется докинг большого числалигандов.Докинг программой SOL соединений с известными активностями в отношенииурокиназы показал способность программы отделять активные соединения отнеактивных (с некоторой долей ложных результатов).
Поэтому следующим шагомстал поиск активных соединений в базах данных готовых соединений (в которыевошли базы данных ZINC, ACB Blocks, Vitas-M Lab) с помощью программы SOL. Порезультатам анализа докинга было заказано 44 соединения, 14 из которых показалислабую ингибирующую активность. Чтобы находить соединения, обладающиебольшей ингибирующей активностью, был предпринят следующий шаг – включениепостпроцессинга в процедуру молекулярного моделирования.Процедура постпроцессинга в рамах силового поля MMFF94 была выполнена спомощью программы DISCORE.
Предварительно было проведено сравнениеконтинуальных моделей растворителя для расчета энергий гидратации как малыхмолекул, так и белков, с результатами экспериментальных данных и молекулярнойдинамики.Обучение программы DISCORE было проведено на известных ингибиторахурокиназы. И для обучающего и для тестового набора наблюдалось улучшениекорреляции рассчитанных значений энергий с экспериментальными, а такжеуменьшение числа ложно положительных результатов (таблица 3).Такжепроцедураполуэмпирическихпостпроцессингаквантово-химическихбылавыполненаврамкахрасчетов: в этом случае локальнаяоптимизация атомов комплекса белок-лиганд проводилось с помощью программногокомплекса MOPAC с использованием метода параметризации PM7 в результате чего13рассчитывались энтальпии образования комплекса белок-лиганд.
Тестированиепрограммы на 10 нативных комплексах урокиназа-лиганд показало, во-первых,важность учета растворителя при таких расчетах, а также необходимость учетаподвижности атомов белка. При этом оптимальным кажется включение воптимизацию не всех атомов белка, а только ближайших атомов белка,расположенных не далее, чем на расстоянии 2 Ǻ от одного из атомов лиганда.Таблица 3.
Сравнение коэффициентов корреляции и числа ложно положительных иложно отрицательных результатов для 89 комплексов для программы докинга SOL(89 комплексов) и программы докинга DISCORE, обученной на наборе из 50урокиназных комплексов.Число ложноЧисло ложноположительныхотрицательныхрезультатоврезультатов0.452850.58830.52940.55177КоэффициенткорреляцииДокинг SOL (все комплексы)Постпроцессинг Discore(обучающий набор)Постпроцессинг Discore(тестовый набор)Постпроцессинг Discore (всекомплексы)Помимо поиска новых соединений - кандидатов в ингибиторы урокиназы - вбазах данных готовых соединений также был выполнен дизайн новых оригинальныхструктур потенциальных ингибиторов урокиназы. В результате синтеза и проверкипредложенных структур in vitro из 18 синтезированных соединений 8 проявилиингибирующую активность в отношении урокиназы. Для 6 активных соединений IC50составляет 200 μM и более.
Среди синтезированных и проверенных в экспериментесоединений можно выделить два наиболее активных ингибитора урокиназы: 1,2бензотиазол-3-ил-гуанидин (IC50 = 33 μM) и его 5-бром производная (IC50 = 4-20μM) (рисунок 2).По полученным экспериментальным результатам для каждого методавычисления энергии связывания белок-лиганд были рассчитаны коэффициентыкорреляции с экспериментальными данными. В случае программы SOL он составил (-0.2), при использовании программы DISCORE – 0.12, при докинге с помощью FLM14– 0.10, и при вычислении энтальпий связывания в MOPAC – 0.52.
Таким образом,корреляция с экспериментальными данными наблюдалась только в случае квантовохимических расчетов.NH2NH2HNHNNHNHBrNNSSU024RU026RРис. 2. Структуры соединений U024R и U026R.Четвертаяглавапосвященаприменениюметодовкомпьютерногомоделирования для поиска новых ингибиторов протеинкиназы PAK1. Посколькуположение некаталитического активного центра белка PAK1 точно не известно,первым этапом работы стало определение этого активного центра с помощью докингаингибитора BPIPP в разные области белка.
В результате был выбран куб докинга k11с координатами в структуре 1F3M - (X, Y, Z; длина ребра)=(12.0, 6.0, 47.0; 32)(рисунок 3). При этом куб докинга включает в себя четыре области связывания(кармана), в которые ложатся различные изомеры и таутомеры соединения BPIPP.Поиск новых ингибиторов PAK1 проводился в базе данных НациональногоИнститута Рака, США, NCI Diversity, содержащей около 1888 интересных дляданного исследования соединений.
В результате докинга программой SOL 41соединение было отобрано для экспериментальной проверки. Среди них 17соединений показали активность в отношении PAK1 в экспериментах in vitro иоказались как ингибиторами, так и активаторами PAK1.ПостпроцессингбылпроведенвпрограммномкомплексеMOPAC:оптимизировалось положение лиганда и ближайших атомов белка, находящихся нарасстоянии до 2 Å от лиганда, с учетом растворителя на последнем шаге. При этомкорреляции рассчитанных в MOPAC энтальпий с энергиями, полученными изэкспериментальных данных, хотя и оказались невысокими (что может бытьследствием неконкурентного механизма действия данных соединений), но возрослиотносительно корреляций результатов программы SOL и составили соответственно0.17 для pH=8 и 0.21 для pH=7.15Рис.
3. Структура белка PAK1 и пространство куба докинга k11.В ходе докинга соединения из NCI занимали те же области (карманысвязывания) I, II, III и IV, что и конформеры и изомеры соединения BPIPP. Длякаждогоизэтихкармановбыливыявленыособенностииопределеныаминокислотные остатки, играющие роль при взаимодействии лиганда и белка.Карман I имеет довольно узкую геометрию и требует очень точногосоответствия заходящего в него соединения этой геометрии. Основной вклад вовзаимодействие с лигандом вносят положительно заряженный Lys135 (цепь А), атакже Pro428 и Met424 (цепь С), причем известно, что две последнихаминокислотных остатка принимают участие в связывании областей субстрата вкаталитическом домене и включены в процесс распознавания субстрата.
Также вовзаимодействие дополнительно могут быть включены аминокислотные остаткиVal425, Gly426, Trp430, и Pro469 каталитической цепи C.Карман II полностью открыт, и соединениям зайти в него гораздо проще, чем вкарман I. Также, это единственный карман связывания, в котором все «задоченные»соединения стимулировали киназную активность. Среди аминокислот белка,вносящих значительный вклад во взаимодействие с лигандом, можно выделитьAsn138 (цепь А) и Thr136 (цепь А), а также His86 (цепь B). Кроме того, геометрияданного кармана определяется взаимодействиями с Val87 и Ala91 цепи B.В случае кармана III лишь несколько из «задоченных» лигандов оказалисьспособны активировать PAK1, причем все эти лиганды обладали множественнымиотрицательнымизарядами,чтоделаетихслабымикандидатаминароль16лекарственных средств. В этом кармане можно выделить следующие аминокислоты,ответственные за взаимодействие с лигандом: His83 и Gln102 (цепь А), или внекоторых случаях Gly98 (цепь В), эффективно связываются с отрицательнымифункциональными группами лигандов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
