Процессы агрегации макромолекул белков в водных растворах (1104331), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Сопутствующими ТМдобавками послужили растворимые соли переходных металлов: хлорид меди(Cu), ацетат свинца (Pb) и сульфат кадмия (Cd). Приведены краткиехарактеристики физико-химических свойств использованных элементов и ихсоединений. Подробно изложена методика и условия приготовленияисследуемых систем с заданными параметрами.Описание экспериментальной установкиИзмерения проводились на установке с He-Ne лазером ГН 25-1 ифотоэлектрической регистрацией рассеянного излучения, возможностьюразделения его поляризованной и деполяризованной компонент и управлениятемпературным режимом измерительной ячейки.
В качестве эталоннойжидкости использовался бензол, обеспыленный с помощью многократнойперегонки и помещенный в стеклянную запаянную ампулу. Снятие сигнала,расчеты и обработка данных проводились в автоматическом режименепосредственно в течение эксперимента, для чего было разработаноспециальное приложение.Особенности межмолекулярного взаимодействия в белковых растворах,содержащих ионы тяжелых металловОбнаружено, что характер зависимости В(рН) существенно отличен отописанного в теории Скэтчарда, аналогично тому, что наблюдалось в случаещелочных ТМ. При малых ионных силах коэффициент взаимодействия В сростом рН изменяется по параболическому закону с минимумом в областиизоэлектрической точки, причем принимает отрицательные значения.
Можнопредположить, что это происходит за счет роста третьего члена в формулеСкэтчарда, характеризующего взаимодействия между макроионами и ионамисоли. При дальнейшем увеличении ионной силы наблюдается рост В с ярковыраженным максимумом в области изоэлектрической точки, причем сувеличением ионной силы раствора происходит рост максимума.10543210-1-2-3-4-51,60,8143-33B *10 , ñì ì î ë ü/ã2Z51,20,40,0-0,42pH-0,84,04,24,44,64,85,05,25,45,65,86,0Рис.1: Зависимость коэффициента взаимодействия B от поверхностногозаряда BSA в растворе при различных концентрациях ацетата свинца 1 – безсоли, 2 – µ=0,00075, 3 – µ=0,00105, 4 – µ=0,0012, 5 – µ=0,0015 моль/л.Зависимость эффективной массы рассеивающих частиц в водных растворахбелков от поверхностного заряда макромолекул и ионной силы раствораОбнаружено, что масса рассеивающих частиц не остается постоянной сизменением поверхностного заряда на белке, а имеет максимальнуювеличину в окрестности изоэлектрической точки белка и увеличивается сростом концентрации соли ТМ в растворе, что свидетельствует оформировании крупных молекулярных агрегатов.543210-1-2-3-4-58Z6M *10 , ã/ì î ë ü7654433221pH104,04,24,44,64,85,05,25,45,65,86,0Рис.1: Зависимость массы рассеивающих частиц M от поверхностного зарядаBSA в растворе при различных концентрациях ацетата свинца: 1 – без соли, 2– µ=0,00075, 3 – µ=0,00105, 4 – µ=0,0015 моль/л.11Поляризационныесвойстваисследуемыхрастворовприизмененииводородного показателя и ионной силыПри измерении коэффициента деполяризации для растворов BSA вприсутствии хлорида меди и HSA в присутствии ацетата свинца былиполученысущественнонелинейныекривые,свидетельствующиеобизменении оптической анизотропии рассеивающих частиц.
При этомзначения коэффициента деполяризации уменьшаются с ростом ионной силы,а его зависимость от концентрации свободных протонов приближается клинейной.6543210-1-2-3-4-50,30Z0,251∆ν0,2030,150,1020,054pH0,004,04,24,44,64,85,05,25,45,65,8Рис.2: Зависимость коэффициента деполяризации ∆v поверхностного зарядаBSA в растворе при различных концентрациях ацетата свинца: 1 – µ=0,00075,2 – µ=0,00105, 3 – µ=0,0012, 4 – µ=0,0015 моль/л.Былирассчитанызначенияквадратаанизотропиитензораполяризуемости и средней поляризуемости частиц от поверхностного зарядана белке при различных ионных силах.
Эти величины также приобретаютсущественно нелинейную зависимость от концентрации свободных протоноврастворе, причем их значения растут с увеличением концентрации солитяжелого металла в растворе, а в области изоэлектрической точкинаблюдается экстремум. По всей видимости, кластеры представляют собойкрупные надмолекулярные образования, которые менее симметричны иболее анизотропны по сравнению с отдельными молекулами (по крайнеймере, с точки зрения их поляризационных свойств).126543210-1-2-3-4-5-62,4Z2,031,22γ *10-351,60,820,410,04,0pH4,24,44,64,85,05,25,45,65,86,0Рис.3: Зависимость квадрата анизотропии тензора поляризуемости γ2 отповерхностного заряда BSA в растворе при различных концентрациях ацетатасвинца: 1 – µ=0,00075, 2 – µ=0,00105, 3 – µ=0,0015 моль/л.Влияние температуры на свойства рассеивающих частиц в растворах,содержащих ионы тяжелых металловВсериисывороточногоэкспериментовальбуминов,своднымисодержащимирастворамиацетатяичногосвинцавималыхконцентрациях (µ=0,00105 моль/л), было получено, что кривые зависимостейВ(рН) при изменении температуры раствора в интервале от комнатной до42°С расположены очень близко друг к другу, существенное различиенаблюдается, как и следовало ожидать, только в области изоэлектрическойточки.Исследования показали, что при фиксированном значении водородногопоказателя,близкоммежмолекулярногокизоэлектрическойвзаимодействияточке,увеличиваетсяскоэффициентповышениемтемпературы и имеет максимум вблизи температуры порядка 30°С(вследствие увеличения сил кулоновского отталкивания), а далее послемаксимума начинается спад, который может быть обусловлен необратимымсвертыванием белка (денатурации).
Такое поведение было характерно длявсех исследованных систем.13231,00,9-3B *10 , см моль/г1,10,80,70,60,50,40,30,20,10,0202428323640t, CРис.4: Температурная зависимость коэффициента взаимодействия В длясывороточного альбумина (HSA) вблизи изоэлектрической точки (рН=5,5) врастворе ацетата свинца (µ=0,00105 моль/л).Показано также, что эффективная масса рассеивающих частицуменьшается примерно на порядок с ростом температуры. Этот эффектсвязан, скорее всего, с разрушением надмолекулярных комплексов —кластеров, т.к. тепловая энергия становится больше энергии диполь766M *10 , ã/ì î ëüдипольного взаимодействия.5432102022242628303234363840t, CРис.5: Температурная зависимость массы рассеивающих частиц M дляяичного альбумина (Egg) вблизи изоэлектрической точки (рН=4,9) в раствореацетата свинца (µ=0,00105 моль/л).14ГЛАВА 5 посвящена обсуждению полученных результатов иосвещает два момента.Особенности процесса адсорбции ионов металлов с различными ионнымирадиусами на поверхности белковых молекулВзаимодействие иона с поверхностью белка происходит, как правило, сучастием их гидратных оболочек.
Если энергия связи иона с дипольноймолекулой воды Epq , которая зависит от ионного радиуса, меньше тепловойэнергии kT, то на поверхности ионов вода не будет удерживаться:Eq 2 p w21=.412 πε r0 kTpqВзаимодействуя с поверхностью белка непосредственно, ион металла сбольшим ионным радиусом более прочно связывается с отрицательнозаряженной группой на белке и может образовывать кулоновский комплексна макромолекуле белка с общей гидратной оболочкой. В этом случаеметаллические ионы полностью компенсируют локальный поверхностныйзаряд белковой молекулы.H2O+Na+--++H2OH2O+-+-+++-+-- -+-P+--+-+-Na++-+-+H2O+Cs+Cs+-+-Рис.6: Модель взаимодействия металлов с различными ионными радиусами сзаряженной поверхностью белка.15Изменение характера межмолекулярного взаимодействия в растворах белковпри наличии ионов тяжелых металлов.
Образование дипольных кластеровСближению макромолекул альбуминов препятствует кулоновскоеотталкивание, энергия которого в случае сильно заряженных молекул Eqqобычно больше kT:E qqq2=εl .Эффективное уменьшение поверхностного заряда белка, происходящее врезультате прочного связывания ионов тяжелого металла на поверхностимакромолекулы,можетпривестиктому,взаимодействиямеждумакромолекуламичтостанетосновнымвидомдиполь-дипольное,поскольку белки имеют аномально высокие значения дипольных моментов:E ppp4=6 πε kT l 6 .Очевидно, что поверхностный заряд макромолекулы будет быстроубывать с увеличением концентрации ионов ТМ.
В этом случае характервзаимодействия белковых макромолекул определяется конкуренцией силдиполь-дипольного притяжения и сил кулоновского отталкивания. Еслиэффективный поверхностный заряд Z*→0, что наблюдается в областиизоэлектрической точки, то белковые макромолекулы могут сблизиться напредельно малые расстояния. Это значит, что создаются такие условия(минимум свободной энергии), что молекулам выгоднее объединиться вкомплексы – кластеры.Исследуемый процесс обратим: с возрастанием суммарного заряда набелке силы кулоновского отталкивания вновь начинают преобладать, икластеры разрушаются, причем эффективная масса рассеивающих частицприближается к величине молекулярной массы белка.16+-++-H2 O-++- - +Рис.7: Модель макромолекулярного кластераПоявляющиеся в растворе макромолекулярные комплексы можнорассматривать как зародыши жидкокристаллической фазы.
С этой точкизрения исследуемое явление представляет собой начальный этап фазовогоперехода в упорядоченную мезофазу, дальнейшее развитие котороговозможно при больших концентрациях белка и соли.В ЗАКЛЮЧЕНИИ подведены основные итоги диссертационнойработы, обсуждается научное и практическое значение экспериментальногоисследованияжидкихмолекулярно-динамическихсистемахрастворовоптическипроцессов,происходящиханизотропныхвзаряженныхмакромолекул, обладающих жесткой глобулярной структурой и имеющиханомально высокие дипольные моменты.ПРИЛОЖЕНИЕ определяет экологическую значимость материаловдиссертации и включает три раздела.Первый представляет собой общий обзор антропогенных факторовзагрязнения окружающей среды токсичными веществами, в том числетяжелыми металлами.Второй содержит более подробную информацию об использованных вработе ТМ, их практическом применении, содержании в природе ичеловеческом организме, а также влиянии на здоровье человека и экологиюокружающей среды в целом.Третий раздел касается темы экологического контроля за состояниемокружающей среды и содержит некоторые справочные материалы.17ВЫВОДЫМетодом интегрального рэлеевского рассеяния света проведенысистематическиеисследованияявленияагрегациимакромолекулвлиотропных системах – водных растворах белков (альбуминов), содержащихионы ТМ (свинца, меди и кадмия), – при изменении различных параметровсреды (таких как концентрация макромолекул, водородный показательраствора,концентрацияионовТМ,температурараствора).Дляисследованных систем впервые показано, что:1.Масса кластеров имеет максимальную величину в окрестностиизоэлектрической точки белка и увеличивается с ростом концентрации солиТМ в растворе.2.Характер межмолекулярного взаимодействия в белковых растворах,содержащих соли ТМ, качественно меняется по сравнению с растворами,содержащими ионы легких металлов: при малых ионных силах коэффициентвзаимодействияпринимаетотрицательныезначения,сохраняяпараболическую зависимость от поверхностного заряда белка, а приувеличенииконцентрациисолиТМрезковозрастаетвобластиизоэлектрической точки со сменой знака зависимости.3.Подтверждена гипотеза об аномальной сорбции металлов с большимионнымрадиусомназаряженнойповерхностибелка.Предложенафизическая модель, объясняющая явление агрегации белковых макромолекулна основе сильных диполь-дипольных взаимодействий.4.Впервые экспериментально исследовано влияние температуры наструктуру макромолекулярных кластеров, формирующихся в белковомрастворе, содержащем ионы ТМ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
