Оптические свойства растворов белков, содержащих ионы тяжелых металлов (1104275), страница 3
Текст из файла (страница 3)
6).15а)0,30б)P0,300,150,1520,00P20,001-0,151-0,15-0,300,00,10,20,30,4сBSA, мг/мл-0,300,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6cBSA, мг/млРис. 6. Зависимости степени поляризации флуоресценции частиц в растворах БСА + хелатEu: а) СEu-ЭДТА=2,9·10-5М; б) СEu-ЭДТА=4,9·10-5М; кривые 1 ― соответствуют воднымрастворам; 2 ― 60% растворам глицерина.§5 посвящен исследованию спектров и поляризации флуоресценциирастворов БСА при возбуждении в ультрафиолетовом диапазоне длин волн.Исследования проводились в водных растворах и 60%-х растворахглицерина, для определения P0.
На Рис. 7а приведены зависимостиинтенсивностифлуоресценцииальбуминавводныхрастворахпридобавлении ионов металлов ― тяжелого Pb2+ и легкого Na+.а)б)Iотн-6BSA (6,4·10 M)-6+-3BSA (6,4·10 M) + Na (5,6·10 M)-62+-10BSA (6,4·10 M) + Pb (8,3·10 M)-62+-7BSA (6,4·10 M) + Pb (1,7·10 M)-62+-5BSA (6,4·10 M) + Pb (6,3·10 M)800tвр, нс806006040040200200300350400λ, нм450-6023+45678pHРис. 7 а) Интенсивность флуоресценции в растворах БСА (рН 7) при добавлении ионовметаллов при возбуждении на 270нм; б) Зависимость от рН времени корреляциивращательной подвижности частиц в растворах БСА, содержащих ионы свинца, посравнению с раствором БСА с ионами натрия.16-3BSA (6,4·10 M) + Na (5,6·10 M)-62+-10BSA (6,4·10 M) + Pb (8,3·10 M)-62+-7BSA (6,4·10 M) + Pb (1,7·10 M)-62+-5BSA (6,4·10 M) + Pb (6,3·10 M)Эффектуменьшениязначенияинтенсивностиприувеличенииконцентрации Pb2+ (Рис.
7а) можно объяснить изменением энергетическихуровней флуоресценции при происходящей агрегации молекул альбумина.Явлениеагрегации,иликластеризации,такжеподтверждаютконцентрационные зависимости τвр(рН) (Рис. 7б). Времена корреляциивращательной подвижности частиц в растворах альбумина при добавленииионовсвинцаувеличиваютсяпочтинапорядокпосравнениюссоответствующим значением τвр гидратированного белка в растворе cионами натрия.На Рис.
8а приведен расчетный график зависимости отношения масснаночастиц к массе молекулы альбумина от логарифма отношениямолярных концентраций белка и ацетата свинца при рН 5.а)б)M/M065pH 5M0=66500 Да80tвр, нсpH 5 pH 4,5pH 5,5pH 6,5pH 7pH 3,56044032021-4-3-2-101log CPb/CBSA0-10-8-6log CPb-4CMlog PbC BSA , рассчитанная из параметров флуоресценции водныхРис. 8 а) Зависимость M 0 отрастворов БСА + ацетат Pb; б) Зависимость τ rot от log C Pb в растворах БСА с ацетатомсвинца при разных рН.MИз графика (Рис.
8а) видно, что отношение M0 растет при увеличенииотносительной концентрации свинца в растворах. На Рис. 8б показаназависимость времен корреляции вращательной подвижности частиц врастворах белка с ацетатом свинца от логарифма концентрации свинца для17различных значений рН. Наибольшее время корреляции наблюдается прирН 5, т.е. в области изоэлектрической точки белка.В §6 четвертой главы приведены данные по исследованию растворовсыворотки крови.
Оказалось, что флуоресценция сыворотки обусловлена восновномфлуоресценциейтриптофана:максимумыфлуоресцентныхспектров наблюдались в области 350 нм. Интенсивность в максимумеспектров зависела от объемного содержания сыворотки в приготовленныхрастворах. Интегральные значения времен корреляции вращательнойподвижности белков, содержащихся в сыворотке крови, для онкологическихбольных не зависят от рН, что можно объяснить возможной потерейбелками транспортной функции при подобных заболеваниях.Пятая глава посвящена обсуждению полученных экспериментальныхрезультатов(§§1-3),атакжеобзоруэкспериментальныхданных,полученных независимо с помощью других оптических методов (§4).В §1 приведен сравнительный обзор экспериментальных данных поисследованиюрастворовнаразныхэкспериментальныхустановках:фирменных спектрофлуориметрах «Хитачи» и «Перкин-Элмер» и наустановке с Ar-лазером.
Выяснилось, что данные измерений на разныхэкспериментальных установках хорошо соотносятся между собой идополняют друг друга.В§2проведенсравнительныйанализвременвращательнойподвижности и масс частиц в растворах БСА с токсичными ионами посравнению с теоретически рассчитанными для молекул БСА в водномокружении. В растворах БСА + соль Cd2+ по Рис.2, в соответствии с (2)оценены τвр и М частиц. Оказалось, что массы частиц в растворах БСА(СБСА=5,6·10-6М) + CdSO4 (СCd=3,3·10-3М) увеличиваются в 6 раз посравнению с массами молекул БСА. Массы частиц в растворах БСА + ацетатPb (C Pb=1,3÷4,9) возрастают в 3 раза по сравнению с массой молекулыC BSAБСА.
Массы частиц в растворах БСА (СБСА=7,5·10-7÷9,0·10-6М) + хелат Eu18(CEu-ЭДТА=2,9·10-5÷4,9·10-5М) примерно в 8 раз больше, чем масса молекулыБСА.В §3 проведен расчет сорбции красителя на поверхности альбумина потеории Ленгмюра для некоторых исследованных систем растворов.§4 содержит экспериментальные зависимости радиусов и масс частиц врастворах БСА+хелат Eu, полученные методами интегрального рассеяниясвета и корреляционной спектроскопии.Согласно теории Дебая, для разбавленных растворов макромолекулможно написать следующее вириальное разложение по концентрации c:cHK1(1 + 2 BMc + ...) , где величина H определяется формулой: H ==R90M⎛ dn ⎞2π n ⎜ ⎟⎝ dc ⎠К – фактор Кабана, n0 ― показатель преломления растворителя,220λ4 N Adndc2,―инкремент показателя преломления раствора, λ ― длина волны возбуждениялазера,R 90 =2 π 2 cnλ N40A20(dn)dc1 ∂ПRT ∂ c2, П – осмотическое давление раствора.
Из этогоуравнения можно определить массу макромолекулы М и коэффициентмежмолекулярного взаимодействия B.Динамическое рассеяние света связано также как и статическоерассеяние с флуктуациями концентрации рассеивающих частиц. Длярастворов макромолекул корреляционная функция G(t), описывающаямолекулярноедвижение,связанаскоэффициентомтрансляционнойдиффузии Dt: G (t ) = G0 exp(− Dt k 2t ) , k ― волновой вектор, Dt =kT, Rh ―6πηRhгидродинамический радиус.На Рис. 9 показана зависимость массы рассеивающих частиц от рН дляраствора БСА, содержащего хелат Eu.Значения гидродинамических радиусов частиц в растворах БСА придобавлении хелата Eu, полученные с помощью метода корреляции фотонов,19возрастают примерно в 2 раза по сравнению с радиусом молекул БСА вводе.Рис. 9 Зависимость массы рассеивающих частиц от заряда на белке в растворах БСА,содержащих хелат Eu(СБСА = 9,6·10-7М, СEu-ЭДТА = 9,5·10-7М).Методамисветорассеянияикорреляционнойспектроскопииподтверждено увеличение средних гидродинамических радиусов частиц врастворах БСА, содержащих комплексон Eu, а также зависимость ростамассы наночастиц от рН раствора с максимумом в изоэлектрической точкебелка.В заключении подведены основные итоги диссертационной работы исформулированы выводы.20ВЫВОДЫ1.
Исследования флуоресценции красителей флуоресцеина, TNS и DSY врастворах БСА с ионами токсичных металлов Pb2+ и Cd2+ показали, чтоинтенсивность флуоресценции в области малых концентраций линейнорастет с ростом концентрации тяжелых ионов. Степень поляризациифлуоресценции красителей и времена корреляции вращательнойподвижности частиц в растворах БСА, содержащих ионы металлов Pb2+и Cd2+, увеличиваются.2. Времена корреляции вращательной подвижности и рассчитанныемассы частиц в растворах БСА, содержащих ионы Cd2+ и Pb2+,возрастают примерно на порядок по сравнению со временамикорреляции вращательной подвижности молекул белка в водномрастворе и в растворе, содержащем ионы Na+, что согласуется сданными полученными методом светорассеяния.3.
Обнаружено, что добавление хелата Eu3+ в растворы БСА смещаетмаксимум флуоресцентного спектра в более коротковолновую область,чтосвидетельствуетовзаимодействиимолекулхелатасповерхностными группами альбумина.4. Обнаруженообразованиенаночастиц―белковыхкластеровврастворах БСА, содержащих хелат европия. Времена корреляциивращательной подвижности в этом случае примерно на порядокбольше, чем для молекул альбумина в водном растворе, что такжеподтверждено с помощью метода светорассеяния.5. Показано, что предложенная методика позволяет определять ничтожномалые концентрации токсичных ионов в растворах (~10-10М), чтовозможно использовать для экологического мониторинга.6. Эффективные(суммарные)временакорреляциивращательнойподвижности частиц в растворах сыворотки крови онкологическихбольных не зависят от рН, что возможно связано с потерей зарядабелками в случае онкологических заболеваний.21Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:Статьи:1.
Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Рыжиков Б.Д., Акимов В.А., СоколН.В., Образование дипольных кластеров в растворах альбумина,содержащих ионы кадмия и комплексоны хелата европия // ВестникМГУ. ― 2003. 3, 5. ― С. 32.2. Petrova G. P., Petrusevich Y. M., Sokol N. V., Ten D. I., ProteinAggregation Processes in Solutions Containing Heavy Metal and ChelateIons: Studying by Laser Light Scattering and Polarized FluorescenceMethods // SPIE, ALT’03. ― 2003.
Vol. 5, No 30, 5486-7. ― Р. 43.3. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Сокол Н.В. и др. Структурныефазовые переходы в растворах белков, содержащих ионы легких итяжелых металлов. ― М., 2005. ― (Препринт / физ. ф-т МГУ, №2).4. Петрова Г.П., Сокол Н.В., Флуоресценция растворов альбумина,содержащих ионы Pb2+ и Cd2+ // Вестник МГУ. ― 2006. 3 (в печати).Тезисы докладов:1.
Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Sokol N.V., Ten D.I., Protein aggregationprocesses in solutions in presence of heavy metals and chelate ions studiedby laser light scattering and polarized fluorescence // ALT’03 BiomedicalOptics, Proc. оf SPIE. ― Bellingham: WA, 2004. Vol. 5486. ― Р. 43.2. Сокол Н.В., Исследование белковых растворов, содержащих тяжелыеионы, методом поляризованной флуоресценции // Межд. конф.студентов, аспирантов и молодых ученых по фунд. наукам Ломоносов2004, секция физика. ― M.: физ.
ф-т МГУ, 2004. ― С. 210.3. Сокол Н.В., Взаимодействие ионов кадмия и хелата европия ссывороточным альбумином в водных растворах // Экологическаяфизика. ― М.: физ. ф-т МГУ, 2004. ― С. 123.224. Petrova G. P., Petrusevich Yu. M., Garkusha E.V., Pleshkova M.S., SokolN.V., Rizhikov B. D., Ten D. I., Zhukov P. G., Formation and destructionof dipole nanostructures in proteins water solutions contained heavy metalions in free and chelate forms.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
