Оптические свойства растворов белков, содержащих ионы тяжелых металлов (1104275), страница 2
Текст из файла (страница 2)
В §1 изложены основные положения теории ДебаяХюккеля, описывающей поведение полиэлектролитов в растворе в светепростейшей модели твердых сфер, погруженных в сплошную среду ивзаимодействующих по закону Кулона. Согласно этой теории, каждаямолекула оказывается окруженной атмосферой противоионов, что приводитк частичной экранировке кулоновских взаимодействий. Даны определенияионнойсилы,коэффициентаактивностиионов,рНсредыиизоэлектрической точки.В §2 изложена теория взаимодействия в растворах электролитов.Описаны виды слабых взаимодействий между молекулами растворов.В §3 описан механизм взаимодействия ионов металлов с заряженнымимакромолекулами в растворах, приведен обзор экспериментальных работ поисследованию растворов белков с ионами тяжелых металлов.
Белки врастворепредставляютсобойполиэлектролиты,основнымвидомвзаимодействия между которыми является кулоновское отталкивание. Ионытяжелыхметалловбудутвзаимодействоватьспротивоположнозаряженными группами на поверхности белка, нейтрализуя тем самым9суммарный поверхностный заряд макромолекул. В этом случае характервзаимодействия белковых макромолекул будет определяться конкуренциейсил диполь-дипольного притяжения и сил кулоновского отталкивания.СогласноСкэтчарду,свободнаяэнергиямежмолекулярноговзаимодействия в таких растворах определяется вторым вириальнымкоэффициентом B:B=β 232 c3 ⎞V1 ⎛ Z 2 β 22⎟,⎜+−M 22 ⎜⎝ 4c32 4 + 2 β 33c3 ⎟⎠(1)здесь V1 ― удельный объем растворителя; M2 ― масса макроиона, c3 ―концентрация ионов соли; Z ― суммарный заряд на белковой поверхности.Параметрыβijхарактеризуютэффектисключенногообъемаивзаимодействие между парами ионов (индекс 2 относится к макромолекуламбелка, 3 – ионам соли).
Очевидно, что коэффициент взаимодействияменяется с ростом суммарного заряда на белке по параболическому закону(эффект Доннана) с минимумом в изоэлектрической точке.Таким образом, если эффективный поверхностный заряд Z→0, чтонаблюдаетсявобластиизоэлектрическойточки,тобелковыемакромолекулы могут сблизиться на предельно малые расстояния. Этозначит, что создаются такие условия (при минимуме свободной энергии),что молекулам выгоднее объединиться в комплексы ― кластеры.Вторая глава посвящена описанию методов люминесцентногоанализа. Рассмотрены физические основы явления флуоресценции иосновные законы флуоресценции (§1). Описан экспериментальный методполяризации флуоресценции (§2), а также экспериментальные установки(§3) и методика проведения эксперимента (§4).Свечение атомов, молекул, ионов и других, более сложных соединений,возникающееврезультатеиспусканияфотоновизэлектронно-возбужденных состояний в этих частицах, называется люминесценцией.10В основе экспериментального метода поляризации флуоресценции,применяемого в данной работе, лежит последовательное измерениекомпонентинтенсивностиперпендикулярнымфлуоресценциинаправлениямиспараллельнымполяризации.иФлуорофорамипоглощаются в основном те фотоны, у которых электрические векторысветовой волны направлены параллельно диполю поглощения флуорофорапри переходе в возбужденное состояние.
Для каждого флуорофора диполипоглощения и испускания имеют фиксированную ориентацию, а угол междуними определяет максимальную измеряемую поляризацию флуоресценцииР.СогласнотеорииЛевшина-Перрена,привращательнойдеполяризацииполяризованномлюминесценциивозбуждениисправедливосоотношение:1 1 ⎛ 1 1 ⎞ τ фл=+⎜ − ⎟;P P0 ⎜⎝ P0 3 ⎟⎠ τ врτ вр =Vη Mη=;kT ρkT(2)здесь Р ― наблюдаемая степень поляризации; Р0 ― ее предельное значениев отсутствие деполяризации; V, М ― объем и масса вращающейсямолекулы; ρ ― ее плотность; τфл ― время жизни возбужденного состояния;τвр ― время корреляции вращательной подвижности (переориентации)молекулы; η ― вязкость раствора.Степеньполяризацииубываетсуменьшениемвремениориентационной корреляции излучающей молекулы и может служить меройее вращательной подвижности. Именно на этой зависимости основан методполяризации флуоресценции.Основная часть исследований проводилась на оптической установке сAr-лазером ILA-120 и фотоэлектрической регистрацией излучения (Рис.
1).Исследования проводились на длине волны 460 нм (мощность излучения ~15мВт).Спектрыфлуоресценцииснималисьспектрофлуориметрах «Хитачи» и «Перкин Элмер».11нафирменныхРис. 1. Схема оптической установки на основе Ar-лазера с изображением хода лучей.Третьяглавапосвященаописаниюфизическихсвойств,флуоресцентных характеристик исследуемых в работе веществ. В нейсодержатся общие сведения о химическом составе и строении исследуемыхвеществ: макромолекул БСА; тяжелых металлов свинца и кадмия в составесолей Pb(CH3COO)2 и CdSO4; хелата европия ― соединения Eu3+ с ЭДТА; атакже специально подобранных флуоресцентных красителей: DSY, TNS,флуоресцеина.В четвертой главе содержится экспериментальная часть работы.Приводятся данные, полученные в результате исследования спектральныххарактеристик систем растворов, зависимости характеристик макромолекулотразличныхпараметров(концентрациитоксичныхсоединений,концентрации белка, рН среды), проведенные математические расчеты иоценки.§1 посвящен исследованию спектров и поляризации флуоресценциибелковых растворов при добавлении красителя флуоресцеина.
Зависимостьстепени поляризации флуоресценции зонда в водных растворах белка ирастворах белка с солью тяжелого металла Cd приведена на Рис.2.120,10P0,0520,001-0,05-0,100,00,20,4cFITS, мг/млРис. 2. Поляризация флуоресценции растворов (рН 7) в зависимости от концентрациифлуоресцеина (λвозб=4579Å):1 ― БСА (СБСА=5,6·10-6М) + флуоресцеин;2 ― БСА (СБСА=5,6·10-6М) + CdSO4 (СCd=3,3·10-3М) + флуоресцеин.В области малых концентраций красителя, где еще не происходитконцентрационноготушения,степеньполяризациифлуоресценциикрасителя имеет бóльшую величину в растворах белка, содержащих ионыкадмия.
В соответствии с формулой (2) это свидетельствует о росте временикорреляции вращательной подвижности частиц в этих растворах, аследовательно о росте средней эффективной массы частиц.§2 четвертой главы посвящен исследованию спектров и поляризациифлуоресценции белковых растворов при добавлении флуоресцентногокрасителя TNS. Было выявлено свойство данного красителя увеличиватьквантовый выход флуоресценции при присоединении к поверхности белка.При добавлении малых концентраций соли Pb2+ в растворы альбумина скрасителем, интенсивность флуоресценции красителя увеличивалась сростом концентрации свинца.
Интенсивность флуоресценции красителя врастворах с концентрацией Pb2+, не превышающей ПДК, практически неотличалась от значений интенсивности флуоресценции растворов безтяжелых ионов. Значения степени поляризации частиц в растворах13альбумина с Pb2+, как и в случае с Cd2+, были больше значений дляальбумина в водном растворе. Что также подтверждает увеличение массычастиц в растворах белка с тяжелыми ионами, связанное с объединениембелковых молекул в кластеры.§3 посвящен исследованию спектров и поляризации флуоресценциибелковых растворов при добавлении флуоресцентного красителя DSY.Интенсивность флуоресценции DSY увеличивалась в растворах белка,содержащих ионы тяжелого металла.В §4 приведены данные по исследованию флуоресцентных спектров иполяризации флуоресценции растворов БСА при добавлении хелата европия(Eu-ЭДТА).СпектрыхелатаEuимеют3выраженныхмаксимума,интенсивность флуоресценции в которых зависит от концентрации хелата ирН среды (Рис.
3).а)б)Рис. 3 а) Спектры флуоресценции растворов хелата Eu, Iотн(λисп), λвозб=460нм:1 ― CEu-ЭДТА=232·10-5М; 2 ― CEu-ЭДТА=116·10-5М; 3 ― CEu-ЭДТА=15·10-5М; б) рН-зависимостиотносительной интенсивности флуоресценции Eu-ЭДТА в водных растворах для трехмаксимумов флуоресцентного спектра (λвозб=457,9нм):1 ― λфл=512нм; 2 ― λфл=600нм; 3 ― λфл=622нм.Оказалось, что добавление альбумина в водный раствор хелата Euприводит к смещению максимума интенсивности в спектре испускания вболее коротковолновую область (Рис.
3). Интенсивность флуоресценции14Eu3+ в растворах хелата с альбумином зависит от рН и достигаетмаксимальных значений в области рН 5 (Рис. 5).Рис. 4. Спектры поглощения раствора хелата европия по сравнению с флуоресцентнымиспектрами растворов БСА с хелатом европия (рН 7), Iотн(λисп), λвозб=460нм:1 ― CEu-ЭДТА=14,5·10-5 М;2 ― CBSA=3,3·10-5 М, CEu-ЭДТА=5,7·10-5 М.Рис. 5. Зависимость интенсивности флуоресценции водных растворов БСА (СБСА=8,3·106М)+хелат Eu (СEu-ЭДТА=4,2·10-6М) от рН среды.По исследованию поляризации флуоресценции хелата Eu в 60%-храстворах глицерина с белком были найдены значения предельной степениполяризации Р0 (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
