Определение фотофизических параметров хлорофилла а в фотосинтезирующих организмах методом нелинейной лазерной флуориметрии (1104207), страница 3
Текст из файла (страница 3)
В пункте 1.5.1описывается созданный в ходе выполнения работы лазерный спектрометр длянелинейной флуориметрии, схема которого приведена на Рисунке 1. Для возбуждения флуоресценции в нем используются два твердотельных лазерных излучателя: 1) излучатель (1), состоящий из чип–лазера (2) с активным элементом изYAG:Nd3+ с диодной накачкой (3) и пассивной синхронизацией мод, генерирующего импульсы длительностью 0,3 нс, двух каскадов усиления (4, 5) (с активными элементами из YAG:Nd3+ с ламповой накачкой), один из которых может пре12образовываться в генератор лазерных импульсов длительностью 20 нс, и узлаумножения частоты (6); 2) однокаскадный излучатель (7) с активным элементомиз YAlO3:Nd3+, генерирующий импульсы длительностью 20 нс на длине волны1340 нм, которые преобразуются во вторую гармонику (длина волны 667 нм) вузле умножения частоты (8).Рисунок 1. Схема лазерного спектрометра для нелинейной флуориметрии фотосинтезирующих организмов.Выходное лазерное излучение на длине волны 667 нм применяется параллельнос возбуждением на длине волны 532 нм и позволяет определить дополнительный набор параметров, в частности, сечение поглощения хлорофилла а.
Выходная мощность обоих излучателей плавно регулируется с помощью электрооптических ячеек Поккельса (9, 10). Кювета с исследуемым объектом помещается вкюветный блок (11) с магнитной мешалкой. Для регистрации сигнала флуоресценции применяется фотоэлектронный умножитель (12), спектральная селекцияосуществляется с помощью узкополосного интерференционного фильтра с максимумом пропускания на длине волны 685 нм, что соответствует положениюмаксимума полосы флуоресценции хлорофилла а. Для регистрации реперногосигнала, пропорционального интенсивности возбуждения, применяется PIN–фотодиод с трансимпедансным предусилителем (13) (динамический диапазон по13рядка 104), на который светоделительной пластиной направляется прошедшеечерез кювету лазерное излучение.
Для оцифровки сигналов с детекторов используются 16–битные АЦП (14), оптически синхронизированные с лазерными импульсами с помощью PIN–фотодиода с предусилителем (15), работающего в режиме насыщения. С учетом нелинейности и шумов полный динамический диапазон системы регистрации составляет не менее 5000, амплитуда шума не превышает 5 %. На Рисунке 2 приведены типичные кривые насыщения флуоресценции ФСО, измеренные на описанном флуориметре.Рисунок 2. Кривые насыщения флуоресценции микроводоросли Chlorellapyrenoidosa, находящейся в различных функциональных состояниях. Точки —экспериментальные данные; кривые построены по теоретической моделис использованием значений фотофизических параметров, определенныхв результате решения обратной задачи.Пункт 1.5.2 посвящен описанию методики измерения кривых насыщения.
В немизложены процедуры калибровки лазерного спектрометра, определения характеристики линейности системы регистрации, а также учета пространственно–временного распределения лазерных импульсов при решении обратной задачи.В разделе 1.6 анализируются полученные в Главе 1 результаты и формулируются выводы к данному разделу работы.14Глава 2 посвящена первому применению метода нелинейной лазернойфлуориметрии (с использованием предложенных в Главе 1 подходов) для изучения нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла а в светособирающих комплексах ФСО. Во введении к данному разделу кратко анализируются причины интереса к нефотохимическому тушению для фундаментальной лазерной физики, в частности, лазерной флуоресцентной спектроскопии. Вразделе 2.2 дается обзор литературных данных по основным аспектам биофизики фотосинтеза, необходимых для изложения оригинальных материалов.
Впункте 2.2.1 описываются каналы дезактивации возбужденных состояний молекул хлорофилла а в ФСО и вводится понятие нефотохимического тушения —группы механизмов, развивающихся под воздействием избыточного освещенияи направленных на увеличение скорости безызлучательной релаксации возбужденных состояний хлорофилла а с целью защиты организма от образованиясинглетного кислорода, обладающего сильной окислительной способностью. Впункте 2.2.2 изложены данные по одному из этих механизмов, связанному сосветоиндуцированным превращением вспомогательных пигментов — зеаксантин–зависимому тушению.
Изучению данного механизма посвящена оригинальная часть данной главы. В этом же пункте обсуждается возможная роль белковой субъединицы PsbS в нефотохимическом тушении. Пункт 2.2.3 посвященописанию одного из «классических» флуоресцентных методов исследования идиагностики ФСО — метода индукции и релаксации флуоресценции, которыйприменяется в данной работе в дополнение к методу нелинейной флуориметрии.В разделе 2.3 приведены результаты экспериментов на выделенных препаратах светособирающих комплексов. В пункте 2.3.1 дано краткое описание методики приготовления препаратов и экспериментального протокола. В пункте2.3.2 показано, что в отсутствие зеаксантина белок PsbS не приводит к заметнойагрегации светособирающих комплексов при варьировании pH буферной средыв пределах 6–8; в присутствии зеаксантина при уменьшении pH ниже 6,5 начинает проявляться агрегация препаратов, что проявляется в увеличении скоростибезызлучательной релаксации возбужденных состояний хлорофилла а и ростемаксимальной скорости синглет–синглетной аннигиляции.
Показано, что обра15ботка светособирающих комплексов холатом с целью удаления из них белкаPsbS приводит к уменьшению сечения возбуждения на длине волны 532 нм на15 %. Из этого можно сделать вывод о влиянии холата на структурную организацию препаратов, в частности на локальную концентрацию пигмента лютеина вних.Раздел 2.4 посвящен изучению зеаксантин–зависимого нефотохимическоготушения в клетках микроводоросли Chlorella pyrenoidosa. В пункте 2.4.1 описаны условия и протокол эксперимента. В пункте 2.4.2 с использованием методаиндукции и релаксации флуоресценции показано, что в выбранных для эксперимента условиях доминирующим механизмом тушения является зеаксантин–зависимое. В пункте 2.4.3 методом нелинейной флуориметрии с возбуждением надлинах волн 532 и 667 нм измерена кинетика фотофизических параметров хлорофилла а в фотосинтетическом аппарате при развитии в клетках нефотохимического тушения (Рисунок 3).Рисунок 3.
Кинетика времени линейной дезактивации (круги) и сечения возбуждения на длине волны 532 нм (квадраты) хлорофилла а в клетках микроводоросли Chlorella pyrenoidosa при включении постоянной внешней засветки, индуцирующей нефотохимическое тушение.16Определены константы скорости фотохимического и нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла а, они составили (1,26±0,11) с-1 и(1,39±0,13) с-1 соответственно. Показано, что сечение возбуждения хлорофилла а на длине волны 532 нм, определяемое в основном переносом энергии совспомогательных пигментов (в частности, лютеина), уменьшается при развитиинефотохимического тушения на (5±1)х10-17 см2.
Это может быть объяснено врамках гипотезы о замещении молекул лютеина на зеаксантин. В отсутствие априорных данных о средней концентрации клеток в возбуждаемом лазерным излучением объеме определено сечение поглощения хлорофилла а на длине волны667 нм, составившее (5,2±0,2)х10-16 см2; отношение сечений возбуждения надлинах волн 532 и 667 нм хорошо согласуется с результатами абсорбционнойспектроскопии. Установлена корреляция фотофизических параметров хлорофилла а и коэффициента нефотохимического тушения, определенного методоминдукции и релаксации флуоресценции (Рисунок 4).Рисунок 4.
Зависимость константы максимальной скорости синглет–синглетной аннигиляции (круги) и времени линейной дезактивации (квадраты) возбужденных состояний хлорофилла а от коэффициента нефотохимического тушения. Точки — экспериментальные данные; прямые — результат аппроксимациилинейной зависимостью (коэффициент корреляции R > 0,93).17Линейный характер полученных зависимостей указывает на то, что основнымпроцессом, определяющим эффективность зеаксантин–зависимого тушения является агрегация пигмент–белковых комплексов; вклад прямого тушения хлорофилла а вспомогательными пигментами при этом мал.В разделе 2.5 обсуждаются полученные в Главе 2 результаты.В Главе 3 проведен экспериментальный анализ возможностей метода нелинейной флуориметрии в диагностике ФСО.
Во введении обосновывается фундаментальный и практический интерес к флуоресцентной биодиагностике. Раздел3.2 посвящен обзору литературы по влиянию факторов среды на функциональное состояние фитопланктона, которые условно разделены в диссертационнойработе на два класса — естественные и антропогенные. В пункте 3.2.1 описывается влияние условий роста, в частности, солености среды и содержания азота,— как примеров естественных факторов (подверженных, в частности, глобальному изменению климата) — на ФСО. В пункте 3.2.3 рассматривается влияниена фотосинтетический аппарат антропогенного фактора — присутствия в водеионов тяжелых металлов.В разделе 3.3 на примере трех классов водных ФСО исследовано влияниеусловий роста на фотосинтетический аппарат.
В частности, показано, что диатомовые микроводоросли Thalassiosira weissflogii проявляют высокую чувствительность к изменениям солености и содержания азота. Увеличение концентрации азота в среде в 2 раза приводит к увеличению времени линейной дезактивации больше, чем на порядок, максимальная скорость синглет–синглетной аннигиляции снижается при этом на 30 %. Эти эффекты могут быть объяснены высказанными в ряде цитируемых работ предположениями о влиянии концентрации азотного питания на структурную организацию фотосинтетического аппарата и на количество фотосинтетически активных реакционных центров в нем. Изменение солености среды (как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения ее значения относительно нормального для данного вида ФСО) также приводит к значительному увеличению времени линейной дезактивации, что указывает (вместе с данными, полученными методом индукции и релаксации флуо-18ресценции) на значительное ингибирование фотосинтеза.
В данном разделе также показано, что параметры, определяемые методом нелинейной лазерной флуориметрии и методом индукции и релаксации флуоресценции хорошо согласуются между собой, и совокупность данных методов позволяет сформировать наиболее информативный (на данный момент) подход для диагностики ФСО.Раздел 3.4 посвящен исследованию влияния на параметры хлорофилла а вфотосинтетическом аппарате микроводоросли Chlorella pyrenoidosa присутствияв водной среде ионов меди Cu2+. Показано, что сечение возбуждения на длиневолны 532 нм практически не зависит от присутствия тяжелых металлов. Увеличение времени линейной дезактивации (Рисунок 5) связано с нарушением цепиэлектронного транспорта в клетке; уменьшение скорости синглет–синглетнойаннигиляции можно объяснить показанным в ряде цитируемых работ влияниемионов тяжелых металлов на связь липидной внутриклеточной мембраны с пигмент–белковыми комплексами, и ассоциированными с этим конформационнымиизменениями в последних.Рисунок 5.
Зависимость константы максимальной скорости синглет–синглетной аннигиляции (круги) и времени линейной дезактивации (квадраты) возбужденных состояний хлорофилла а в фотосинтетическом аппарате микроводоросли Chlorella pyrenoidosa от концентрации ионов меди Cu2+ в буфернойсреде. Вертикальная линия отмечает границу ПДК.19Полученные в данном разделе результаты показывают, что фотофизические параметры хлорофилла а позволяют зарегистрировать изменения в состоянии фотосинтетического аппарата уже при концентрациях ионов меди, ниже ПДК, чтоуказывает на принципиальную возможность использования фитопланктона в качестве флуоресцентного биоиндикатора присутствия в воде тяжелых металлов.В разделе 3.5 даются основные выводы к Главе 3.В Заключении формулируются основные результаты и выводы диссертационной работы, которые перечислены ниже.Основные результаты работы1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
