Диссертация (1103978), страница 9
Текст из файла (страница 9)
6а).Помимо возможности подбора радиуса окружности вручную интерфейс программыпозволяет провести автоматический подбор наиболее оптимального значения радиуса.2.4. Итерационный полиномиальный метод вычитания фонаЕще один способ вычитания фона, применяемый в работе предложен авторами статьи[96].
Этот метод является модификацией полиномиальной аппроксимации спектров ииспользует метод наименьших квадратов в сочетании с итеративной полиномиальнойаппроксимацией спектров. При первой итерации проводится аппроксимация спектра, послечего все точки сгенерированной кривой, имеющие значение интенсивности больше, чем уточек исходного спектра, автоматически приписываются точкам исходного спектра. Приповторении нескольких таких итераций, происходит полное исключение линий полезногосигнала из спектра.
В результате исходный экспериментальный спектр превращается вфоновую компоненту, которая в дальнейшем и вычитается из исходного спектра.ИнтерфейспрограммыпредставленнаРис.7.Слевапоказанисходныйэкспериментальный спектр и полученный в результате итераций фоновый сигнал.
Справапредставлен результат работы метода.Рис. 7. Пример работы программы: спектра до (а) и после (б) вычитания фона.352.5. R(ν) представление спектровКак известно, одной из важных проблем анализа КР спектров в низкочастотномдиапазоне является наличие интенсивного крыла линии рассеяния Рэлея. В связи с этимслабые линии спектра в этой области становятся неразличимыми на этом крыле. Одним изспособов, позволяющих решить эту проблему, является использование R(ν) представления дляанализа полученных результатов [97].Спектральнаяплотностьмощностиможетбытьпредставленакаксуммаинтенсивностей стоксовой и антистоксовой линииI(ω) = Iст(ω)+Iаст(ω).Согласно принципу детального баланса Iст(ω)/ Iаст(ω) = exp(- ħω/kT).Предложенная авторами работы функция R(ω) представляется в видеR(ω) = ω(Iст(ω)-Iаст(ω)).С учетом указанных выше выражений это равенство может быть переписаноR(ω) = ω (1-exp(-ħω/kT)) Iст(ω).или, представляя это выражение в общепринятых единицах измерения для КР спектроскопии,получаемR(ν)=ν(1-exp(-hcν/kT))I(ν)Форма рэлеевской линии может быть аппроксимирована лоренцевой кривой.Применение R(ν) преобразования к лоренцевой кривой превращает ее в довольно гладкуюкривую с небольшой интенсивностью и углом наклона.Учитывая разложение экспоненты в ряд и то, что рассматривается низкочастотныйспектральный диапазон, для которого значение hν/kT мало, оставляя в разложении толькопервое линейное слагаемое, получается, что R(ν) ≈ ν2I(ν).
Такая форма представленияпревращает лоренцеву кривую в горизонтальное плато. При этом все информативные линииисходного спектра не меняются.ВрезультатепроведениятакойматематическойобработкиКРспектрывнизкочастотном диапазоне могут анализироваться даже с учетом низкой интенсивностисигнала. Преимущество данного представления для анализа результатов очевидно.36Рис. 8. КР спектр химотрипсина и спектр в представлении R(ν).На Рис. 8 представлены исходный спектр белка в низкочастотном диапазоне, а такжеспектр, полученный в результате R(ν) преобразования.
Отметим, что обработанный спектротмасштабирован, что позволяет увидеть выявленные спектральные особенности.2.6 Аппроксимация линий спектраПолучение информации о спектральных изменениях в некоторых случаях требовалоприменения дополнительных методов обработки. Так, для получения информации оположениях компонент широких составных линий низкочастотных спектров проводиласьаппроксимация фиксированным набором лоренцевых компонент при помощи двух методов –функционалом программного обеспечения «Origin» и программы «GeneHunter» [98],представляющейсобойгенетическийалгоритм,находящийоптимальноерешениепоставленной задачи.Глава 3 Низкочастотная колебательная спектроскопия в исследованиивзаимодействия молекул белка с краун-эфиром§ 1. Низкочастотная ИК-Фурье и ТГц спектроскопия комплексов трис-краун37В связи с тем, что функционирование белка зависит от его структуры, малейшиеизменения в окружающей среде, приводящие к перераспределению энергии взаимодействияаминокислотных остатков, а, значит, к изменению группировки молекулы в пространстве (т.е.ее структуры) могут привести к изменениям в функциональной активности белков.
Так, призамене естественного водного окружения белка органическим растворителем можетпроисходить уменьшение его функциональной активности или даже полное ее изменение. Темне менее, существуют способы, позволяющие увеличить активность белков даже в ненативномокружении. Один из известных методов – добавление молекул краун-эфира к молекуламбелка. Эффект может быть связан со взаимодействием краун-эфира с поверхностнымиаминогруппами белка. Методы колебательной спектроскопии не позволяют напрямуюисследовать поверхностные аминогруппы, так как соответствующие линии в колебательномспектре сильно перекрываются с линией амид I белка. В связи с этим в работе для проверкисуществующихпредставленийиспользовалосьмодельноесоединениетрис(гидроксиметил)аминометан (трис) (HOCH2)3CNH2Рис.
9. Пространственная структура молекулы протонированного триса (HOCH2)3CNH3.Структура триса такова, что у него есть аминогруппа H-N-H, которая можетиспользоваться как модель поверхностных аминогрупп белка, при этом в спектре триса будутотсутствовать характерная для белков линия амид на этой же частоте, что может позволитьисследовать спектральные изменения при взаимодействии этого модельного соединения смолекулами краун-эфира. Конфигурация изучаемой группы атомов в трисе может различаться.В зависимости от значения pH раствора может происходить протонирование аминогруппы, тоестьизменение -NH2 →-NH3+.Значению рН10 раствора соответствуетобычная(непротонированная), а pH3 протонированная формы триса.Изучение биологических объектов в низкочастотном диапазоне спектра являетсясравнительно новым направлением применения методов низкочастотной ИК и ТГцспектроскопии.
Отсутствие широкой базы данных и большого опыта в проведении подобных38экспериментов делает необходимым проводить анализ полученных результатов, используясравнение с «эталонными» данными, полученными при ИК спектроскопии в диапазоне«отпечатков пальцев».1.1. Способы приготовления образцовВ экспериментах были использованы трис(гидроксиметил)аминометан (трис) и краунэфир 18-краун-6 (краун) производства «Реахим», а также белок α-химотрипсин (химотрипсин)производства фирмы «Самсон-мед».
Трис и химотрипсин представляют собой порошки, а 18краун-6 представляет собой прозрачные кристаллы.Комплексы трис–краун при различных pH и молярных концентрациях краунаготовились путем лиофилизации из водного раствора. Сначала растворялось 3 грамма триса в50 мл дистиллированной воды. Раствор делился на две части, и каждая доводилась до нужногозначения pH. В результате получалось два раствора со значениями pH 3 и pH 10.
Для того,чтобы добиться требуемого соотношения молярных концентраций триса и крауна сначалавзвешивались навески крауна, после чего каждая навеска растворялась в соответствующемколичестве раствора триса с нужным pH. В результате получались растворы с отношениеммолярных концентраций триса и крауна 1:1, 1:2, 1:5 и 1:10, соответственно. Эти растворы, атакже растворы чистых триса при pH 3 и pH 10 и чистого крауна лиофилизовались в течение20 часов, в результате чего образовывались поликристаллические образцы с размерамимикрокристаллов 10 – 100 мкм.Для проведения ТГц измерений из получившихся порошкообразных образцов смесейтрис-краун и чистых образцов готовились таблетки диаметром 13 мм в прессе под давлениемоколо 20 МПа. Толщина получавшихся таблеток варьировалась от 150 до 300 мкм.Эксперименты проводились на установке 2. Предварительные эксперименты по ИКФурье спектроскопии показали, что оптическая плотность таблеток образцов толщиной 150 –300 мкм достигает 10.
При этом специфика установки 2 такова, что рабочие значенияоптической плотности составляют 1,5 – 3. Для достижения такой оптической плотностиисследуемых образцов толщины таблеток необходимо было уменьшать до несколькихдесятков микрометров. Такие тонкие таблетки механически нестабильны, поэтому дляизмерений в этой конфигурации приходилось использовать дополнительную матрицу,укрепляющую образец. Одним из способов приготовления смешанных с матрицей образцовявляется прессование таблеток на кружках парафильма (пленка «parafilm M»), толщинойоколо 120 мкм и диаметром 8мм.
В диапазоне 50 – 600 см-1, который позволяет анализироватьконфигурация установки 2 (на пропускание), парафильм не имеет спектральных особенностей39и может служить матрицей для измерений, внося лишь фоновый (медленно меняющийся)вкладвизмеряемыеспектры.Темнеменее,неравномерностьраспределениялиофилизованного порошка по поверхности пленки парафильма приводит к оптическойнеоднородности прессованной таблетки и, следовательно, к увеличению рассеяния ИКизлучения.
В то же время форма спектра приготовленного таким методом образца идентичнаформе спектра образца, спрессованного без матрицы (для образцов, для которых этовозможно). Этот факт позволяет считать возможным такой способ приготовления образца. Темне менее, при этом теряется возможность получать точные значения коэффициентовпоглощения таблеток. Интенсивности основных линий спектра могу различаться на 10 – 30%из-за неоднородности получающихся таким методом смешанных образцов.Для проведения экспериментов по ИК-Фурье спектроскопии в конфигурациинарушенного полного внутреннего отражения достаточно было небольшое количествопорошка положить на измерительный кристалл диаметром 2 мм так, чтобы образец полностьюпокрывал поверхность кристалла, и прижать его специальным наконечником для достиженияусловий возникновения эффекта нарушенного полного внутреннего отражения.1.2.
Анализ зависимости низкочастотных ИК-Фурье и ТГц спектров триса отконцентрации краун-эфираС целью проверки экспериментальных результатов в работе [142] нашим соавторомА.В. Карговским было проведено компьютерное моделирование колебательных спектровпротонированного и непротонированного триса, а также краун-эфира методом теориифункционала плотности. Получившиеся спектры качественно соответствуют измеренным, темне менее, не все рассчитанные значения амплитуд согласуются с экспериментальнымиданными. В связи с этим в работе проводится анализ данных только на основаниирассчитанных частот колебаний.На Рис. 10 представлены полученные в результате измерений на установке 4 ТГцспектры поглощения непротонированного триса (1), крауна (4), смесей трис-краун, ирассчитанные частоты колебаний непротонированного триса (столбцы).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
