Диссертация (1103978), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Функционирование белкатесно связано со структурой его активного центра. Наличие интереса к созданию способовконтроля и управления функционированием белков способствует развитию исследований вобласти спектроскопии с целью определения структуры белка. Известно несколько способовизменения структуры молекулы белка, например, термическая денатурация, ингибирование,взаимодействие с агентами химической денатурации, изменение условий окружающей средымолекулы.Применение водорастворимых белков-ферментов в органических растворителяхпозволяет расширить список продуктов функционирования белков. Становится возможнымподавить протекающие в водной среде побочные реакции и запустить процессысинтезирования новых биологических молекул.Найдены некоторые способы увеличения функциональной активности белков вненативном окружении.
Эффект увеличения активности химотрипсина в органическомрастворителевприсутствиикраун-эфираможетбытьобъясненвзаимодействиемповерхностных аминогрупп белка с молекулами краун-эфира.Исследование структуры белков в «сухом» виде является важной задачей для многихпрактических применений. Такие образцы обладаютрядомпреимуществимогутиспользоваться, например, при очистке белков, подготовке белковых реагентов, производствебелковых молекул для диагностических и терапевтических целей, увеличения стабильностиобразцов при длительном хранении, транспортировке на длительные расстояния, а такжеиспользоваться в технологиях трехмерной печати при создании биологических материалов.25Методы колебательной спектроскопии широко применяются для определенияструктурыбиологическихмолекул.Существуютработыпосоотнесениюлинийколебательного спектра белка и определенных типов колебаний молекулы.
Следовательно,методы спектроскопии могут применяться в качестве инструмента для изучения структурныхизменений молекул белков. Наиболее тщательно на текущий момент исследован диапазон«отпечатков пальцев», тем не менее, низкочастотный спектральный диапазон также являетсяперспективным для применения к изучению структуры молекул. Методы ТГц, низкочастотныхИК и КР спектроскопии постоянно развиваются, что позволяет получать качественные,воспроизводимыеспектрыбелковипроводитьанализспектральныхизменений,появляющихся при изменении структуры исследуемой молекулы белка.Глава 2 Методы измерений и обработка экспериментальных данных§ 1. Описание экспериментальных установокВ диссертации были проведены эксперименты с применением трех спектроскопическихметодов – инфракрасная (ИК) Фурье-спектроскопия, терагерцовая (ТГц) спектроскопия испектроскопия комбинационного рассеяния (КР).1.1. ИК-Фурье спектроскопияДля измерения ИК-Фурье спектров использовался коммерческий спектрометр Nicolet6700 (Рис.
3б). Он позволяет регистрировать спектры в широком ИК диапазоне (50 – 4000 см1). Источник инфракрасного излучения ETC EverGlo, нагретый до рабочей температуры1140оС, испускает излучение в спектральном диапазоне 20 – 9600 см-1 (500-1 мкм). Излучениепопадает на сферическое зеркало и направляется им в интерферометр Майкельсона. Послеинтерферометра пучок направляется на образец системой зеркал.Измерение спектров образцов проводилось в двух конфигурациях. Первая – сприменением дополнительной приставки Smart Orbit (Рис.
3в), использующей принципнарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) для снятия спектров поглощенияобразцов(далее потексту дляупоминания этой конфигурацииустановкибудетиспользоваться название «установка 1»). Эта конфигурация позволяет получать спектрыпоглощения в диапазоне 400 – 4000 см-1. Луч, проходя через приставку НПВО, попадает наобразец (кристаллом, в котором происходит полное внутреннее отражение, является алмаз(n=2,42)).Послеэтогопучокнаправляется26надетектор,которыйрегистрируетавтокорреляционнуюфункциюизлучения.Врезультатенавыходеполучаетсяинтерферограмма, Фурье-преобразование которой позволяет получить спектр.
Далее можнопроводить обработку данных с помощью стандартного программного обеспечения OMNIC.При этом принцип НПВО накладывает условия и ограничения на методикуприготовления образцов для экспериментов. ИК пучок направляется на оптически плотныйкристалл с высоким показателем преломления под строго определенным углом. Как известно,при полном внутреннем отражении всегда возникает слабая, экспоненциально затухающаяволна, которая распространяется за пределы кристалла.
Если поверхность кристалла находитсяв контакте с образцом, то эта волна проходит в образец. Волна распространяется всего нанесколько микрометров (0,5 мкм – 5 мкм) за пределы кристалла, поэтому для того, чтобы онадостигла образца, должен быть обеспечен хороший контакт между образцом и поверхностьюкристалла. Глубина проникновения экспоненциально затухающей волны в образец dпр(расстояние, на котором интенсивность излучения в образце уменьшается в e раз)определяется по формуле [89]d пр 22 n1 sin 2 n22,где n1 – показатель преломления кристалла, а n2 – показатель преломления образца.При взаимодействии с образцом излучение частично поглощается, выходит черездругую границу кристалла и направляется на детектор.
Таким образом, для успешногоприменения метода, необходимо выполнение следующих условий, накладываемых на образеци кристалл:1)Образец должен быть в непосредственном контакте с НПВО кристаллом, таккак появляющаяся при полном внутреннем отражении затухающая волнараспространяется только на небольшое расстояние (несколько микрометров)за пределами кристалла.2)Показатель преломления кристалла должен быть много больше, чем уобразца, иначе не возникнет эффект внутреннего отражения. Обычно НПВОкристаллы имеют показатель преломления от 2,38 до 4,01.3)Кристалл должен быть достаточно твердым, чтобы выдерживать давление,прикладываемое к образцу с целью обеспечения плотного контакта кристаллас образцом.27(а)(в)(б)Рис. 3.
ИК–Фурье спектрометр Nicolet 6700: (а) – оптическая схема спектрометра сприставкой для измерений в режиме на пропускание, (б) – фотография спектрометра,(в) – приставка, использующая принцип НПВО.Второй режим работы прибора, применяемый в экспериментах – режим спектроскопиина пропускание (далее по тексту для упоминания этой конфигурации установки будетиспользоваться название «установка 2»). При этом в отличие от схемы спектроскопии НПВОизлучение, пройдя через интерферометр Майкельсона, системой зеркал направляется прямо наобразец, после чего попадает на детектор.
Эта конфигурация в сочетании с разнымидетекторами позволяет получать спектры во всем диапазоне работы прибора от 50 см-1 вплотьдо 4000 см-1.Программное обеспечение прибора позволяет проводить усреднение спектров понескольким сканам для улучшения качества спектров и увеличения соотношения сигнал/шум.281.2.
Терагерцовая спектроскопияИзмерения в ТГц диапазоне проводились на двух установках с различнымипараметрами.Первая из них – терагерцовый спектрометр ZAP-ABCD фирмы Zomega TerahertzCorporation (далее по тексту при упоминании этой установки будет использоваться название«установка 3»). Это коммерчески доступный терагерцовый спектрометр, который позволяетгенерировать терагерцовые импульсы, а также детектировать прошедшее и отраженноеизлучение в спектральном диапазоне до 30 ТГц. В экспериментах прибор работал в режиме напропускание.ZAP-ABCD система использует окружающий воздух для генерации терагерцовогоизлучения [90].
Лазерное излучение делится на две части – пробный луч и накачку. Пробныйлуч проходит через линию задержки и далее попадает в систему детектирования. Лазерныйимпульс накачки проходит через линзу и нелинейный кристалл β-бората бария (BBO), гдегенерируется вторая гармоника. Далее лазерный импульс накачки и его вторая гармоникаколлинеарнофокусируютсяввоздухе,гдеврезультатенелинейногопроцессачетырехволнового смешения происходит генерация терагерцового импульса.Для минимизации поглощения терагерцового излучения в воздухе (вода сильнопоглощает в терагерцовом диапазоне) измерения проводятся в жидком азоте.Основные параметры установки таковы: длина сканов – 11 пс, спектральный диапазон0.1 – 30 ТГц, центральная частота 10 TГц.
Отношение сигнал/шум составляет 2,5 порядка.Установка позволяет проводить измерения оптической плотности до значений около 3 единиц.Вторая терагерцовая установка, используемая в работе, имеет другой принцип работы(далее по тексту «установка 4») [93]. Исходное лазерное излучение также делится на пробныйпучок и пучок накачки. Генерация терагерцового излучения происходит иначе – припрохождениинакачкичерезнизкотемпературныйнелинейныйкристаллGaAs,длядетектирования используется электрооптический кристалл ZnTe. В качестве источникаоптического излучения используется фемтосекундный твердотельный Ti:Sapphire лазерTsunami (Spectra Physics Inc.).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
