Диссертация (1103978), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Предложена техника обработки и анализанизкочастотных колебательных спектров.Полученные результаты расширяют современные (весьма ограниченные) базы данныхпо низкочастотным колебательным спектрам белковых молекул.Результаты работы могут быть применены для контроля состояния лиофилизованныхбелковыхпрепаратовбелковвразличныхбиотехнологических,терапевтическихидиагностических применениях.Результаты работы позволяют применять методы низкочастотной ИК-Фурье и КРспектроскопии для анализа функционально-значимых структурных изменений и вторичнойструктуры молекул белков.Структура и объем диссертацииДиссертация состоит из введения, 5 глав, содержащих обзор литературных данных,изложение и обсуждение результатов, заключения и списка литературы.
Работа изложена на998 страницах, включает 4 таблицы и 35 иллюстраций. Список литературы включает 150наименований.Глава 1 Применение методов колебательной спектроскопии в изучении молекулбелков и их структурных изменений, происходящих при различныхвоздействиях.§1. Строение молекул белков и особенности функционирования водорастворимыхбелков в неводных средахБелкипредставляютсобойвысокомолекулярныеорганическиевещества–полипептиды, состоящие из аминокислот.
Пептидная связь соединяет аминокислоты в однуцепочку, а образующиеся водородные и дисульфидные связи формируют пространственнуюструктуру молекулы.Для описания строения молекул белков были введены термины первичной, вторичной,третичнойичетвертичнойструктуры,характеризующиеуровнипространственнойорганизации белков. Последовательность аминокислотных остатков в белковой цепиназывается ее первичной структурой.
Вторичная структура описывает конформациюполипептиднойцепи,возникающуюприобразованииводородныхсвязеймеждукарбоксильными кислородными атомами и атомами амидного азота в составе скелетамолекулы. Различают несколько конформаций вторичной структуры белков: α-спирали, βструктуры и неупорядоченные конформации. Под третичной структурой белка понимаюттрехмерную укладку полипептидной цепи, вызванную внутримолекулярным взаимодействиембоковых цепей. Четвертичная структура наблюдается не у всех молекул и представляет собойспособ укладки в пространстве отдельных полипептидных цепей, обладающих одинаковой(или разной) первичной, вторичной или третичной структурой, и формирование единого вструктурном и функциональном отношениях макромолекулярного образования.
Четвертичнаяструктура присуща белкам, состоящим из нескольких полипептидных субъединиц.Функционирование белка определяется строением его активного центра, которыйобразуется в процессе формирования структуры молекулы. Активный центр белка – этоучасток, который имеет строго определенное для данного белка строение – набор несколькихвзаимодействующихрадикаловаминокислот,которыемогутбытьрасположенывполипетидной цепи далеко друг от друга. Активный центр может специфическивзаимодействовать с определенными типами молекул – лигандами, которые при этом иактивируют функции белка. Необходимый тип лигандов определяется свойствами активного10центра, которые зависят как от химических свойств составляющих его аминокислот, так и отих взаимного расположения в пространстве. Отсюда возникает связь структура-функция.
Тоесть, даже незначительные нарушения в структуре белка, в частности, связанные сизменениями условий окружающей среды, могут стать причиной изменения свойствактивного центра и нарушить процесс его взаимодействия с лигандом, то есть нарушить егофункционирование.Нормальноефункционированиеводорастворимогобелка-ферментапредполагаетналичие гидратной оболочки молекулы. Нарушением условий окружающей среды для такихферментов может служить лиофилизация – процесс вывода молекул воды из образца вусловиях низкой температуры и вакуума.
Лиофилизация белков может приводить кизменениям структуры молекул [12]. Например, работа [13] посвящена исследованию влиянияпроцесса лиофилизации на вторичную структуру белка методом ИК-Фурье спектроскопии.Проведен анализ изменений в диапазоне линии амид III в спектрах восьми белков. Показано,что спектры лиофилизованных образцов отличаются от спектров их водных растворов.Соотнесение спектральных изменений с содержанием элементов вторичной структуры былоосуществлено путем аппроксимации линии амид III гауссовыми кривыми.
Результатомисследований является утверждение о том, что для всех белков при лиофилизации происходитуменьшение содержания α-спиралей и увеличение содержания β-структур. Авторами [14]проведен аналогичный анализ ИК-спектров тетанотоксина в различных формах. Результатытакже подтверждают тенденцию к уменьшению содержания α-спиралей и увеличению βструктур в процессе лиофилизации. Дополнительные исследования, проведенные с белком,лиофилизованным из различных растворов, показывают, что влияние на результирующуюструктуру образца оказывает среда, из которой образец лиофилизуется.
Так, наименьшиеструктурные изменения происходят с белком при лиофилизации в присутствии полиэтиленгликоля по сравнению с растворами сорбитола и хлористого натрия.Лиофилизованные образцы обладают рядом преимуществ и могут применяться вразличных областях. Лиофилизация применяется при очистке белков, подготовке белковыхреагентов, производстве белковых молекул для диагностических и терапевтических целей,увеличения стабильности образцов при длительном хранении путем уменьшения содержанияводы в образце, обеспечивающей процессы гидролиза пептидных связей, деамидирования идругих деградационных процессов.
Помимо этого, порошкообразные образцы могут легкотранспортироваться на длительные расстояния, а также использоваться в технологияхтрехмерной печати (3D printing) при создании биологических материалов [15,16].Следует отметить, что после лиофилизации в образце присутствует остаточнаясвязанная вода. Так, например, в работе [17] была исследована стабильность альбумина после11лиофилизации при хранении в различных условиях. Показано, что после лиофилизации вальбумине остается примерно 3% воды (по массе), то есть около 110 молекул воды на однумолекулу альбумина. При длительном хранении при температуре 2-8˚С содержание водынемного увеличивается до 3,3% (121 молекула воды на 1 молекулу белка).
Хранение прикомнатной температуре и влажности в течение 13 недель приводит к увеличению содержанияводы в белке до 4,4 % (162 молекулы воды на одну молекулу альбумина). Авторы работы [18]представляют данные по значению критического содержания воды, достаточного для запускакатализируемой химотрипсином реакции гидролиза в твердой фазе – 142 молекулы воды на 1молекулу химотрипсина, что составляет около 10%.Существует несколько способов контроля структуры белковых молекул. Одними изсамых удобных являются методы колебательной спектроскопии, позволяющие определятьвторичную структуру белков в любом состоянии – в водном растворе, замороженном, сухомсостоянии, даже в виде суспензии. Существует огромное количество работ, в которых методыИК-Фурье и КР спектроскопии применяются для анализа структурных изменений молекулбелков [19,20,21,22,23,24,25,26].Ферменты высоко специфичны к субстратам, участвующим в реакции.
Считается, чтопри попадании в неводное окружение белок меняет свою исходную структуру, вследствиечего прекращает свое функционирование [27]. Тем не менее, в процессе постоянного развитиябиотехнологий появляется все больше интересных задач, для решения которых необходимопреодолевать ограничения, обусловленные природой реагентов. Так, например, существуютнерастворимые в нативной для ферментов (водной) среде реагенты. Побочные реакции могутбыть предпочтительнее главной реакции в водной среде.
Также возможны трудности приизвлечении продукта реакции из водной среды. Преодолеть такие побочные эффекты можнопри замене водной среды, в которой протекает реакция, на органический растворитель.В работах [28,29,30,31,32,33] показано, что для нескольких белков наличие воднойсреды не является обязательным фактором для запуска реакции. Так, в работе [34]продемонстрировано, что кристаллический химотрипсин остается активным и в неводномрастворе метиленхлорида (дихлорметана).
Функциональная активность белка сохраняется ипосле его выдерживания в этом растворе в течение нескольких дней. Позже авторы [35]показали, что при функционировании в неводной среде ферменты проявляют новыекаталитические свойства. Липазы проявляют функциональную активность в различныхрастворителях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
