Диссертация (1103978), страница 16
Текст из файла (страница 16)
При такой обработке также видно, что спектры химотрипсинапри модифицировании белков значительно меняются. Так, если в нативном состоянии ухимотрипсина центральный пик в указанном диапазоне расположен на частоте около 115 см-1,то при термической обработке белка происходит смещение этого пика вправо до частотыоколо 125 см-1, при этом у линии подниматеся плечо на частоте около 140 – 150 см-1.
Согласнорезультатам главы 4 это может говорить о некотором увеличении числа α-спиральныхфрагментов в молекуле химотрипсина при термической денатурации. Разрыв дисульфидныхмостиков приводит к чуть менее значительным изменениям в форме спектра в этом диапазоне,но в целом тенденция к смещению линии в высокочастотную область и появлению плеча улинии налицо. Можно отметить более сильное влияние агента ТКЭФ на химотрипсин, посравнению с агентом ДТТ.Молекула БСА, α-спиральный белок, является более устойчивой по отношению квоздействиям на нее внешних факторов различной природы, о чем говорят менее заметныеизменения в формах спектров. Тем не менее, некоторые различия все же присутствуют (Рис.33).78Рис. 33.
ИК спектры термически денатурированного БСА (1), нативного БСА (2), смеси БСА с ДТТ (3) и смесиБСА с ТКЭФ (4).Наибольшие различия наблюдаются в диапазоне до 120 см-1. Происходит уменьшениекрыла линии на частотах 80 – 120 см-1 в результате воздействия ТКЭФ (4), а также небольшиеизменениязаметнывположениицентральногопикаэтойлиниивспектрахмодифицированных образцов.Самые сильные различия проявляются в спектрах БСА и его модифицированныхсостояний в диапазоне 200 – 280 см-1 (Рис. 31а).
В спектре нативного белка присутствует оченьслабая линия. Взаимодействие с ДТТ приводит к увеличению интенсивности линии на 255 см1. При температурной денатурации и взаимодействии с ТКЭФ линия становится еще болееинтенсивной. В литературных данных линии на частотах от 250 до 260 см-1 могут бытьприписаны к С-С-С изгибным колебаниям [141]. Принимая во внимание тот факт, что притермическойденатурациибелкапроисходитчастичное разворачивание спиралейиобразование β-структур, а также предположения о соотнесении частот элементам структурыбелков, высказанные в предыдущей главе, можно сказать, что разрыв мостиков привзаимодействии с ТКЭФ также приводит к увеличению содержания β-структурных элементовв БСА.В спектрах химотрипсина в этом диапазоне присутствует линия на частоте около 235см-1 (Рис.
31б). По сравнению со спектром нативного белка спектры всех остальных образцов79имеют большую интенсивность широкой линии на частоте около 250 см-1, в результате чегоначинает пропадает провал в спектре.Анализ этого диапазона позволяет сделать вывод о том, что наиболее сильныеизменения происходят при термической денатурации белков. Влияние агента ТКЭФ приводитк похожим изменениям, но проявляется в меньшей степени.Линия на частоте 235 см-1 может быть приписана кручению метильной группы [142], алиния на частоте 290 см-1, проявляющаяся в спектре ингибированного химотрипсина,приписывается С-СN деформационным или N-C торсионным колебаниям.
Линия на частотеоколо 325 см-1 в спектрах всех белков может быть приписана CNC деформационным, С=Oплоскостным изгибам или CCN деформационным колебаниям [143].Рис. 34. ИК-Фурье спектры БСА (а) и химотрипсина (б): 1 - комплексы белок-ТКЭФ, 2 – термическиденатурированные белки, 3 - белок-ДТТ, 4 - нативные белки, 5 - ингибированный химотрипсин.В диапазоне 370 – 600 см-1 в спектрах всех образцов присутствует почти линейныйфоновый сигнал, который затрудняет анализ спектральных изменений.
В связи с этим былапроведена дополнительная обработка экспериментальных данных с целью вычитаниялинейного фона. Обработанные таким образом спектры белков представлены на Рис. 34. Приэтом спектр нативного БСА умножен на коэффициент 2 для удобства сравнения.В спектре БСА наблюдается несимметричная линия в диапазоне 380 – 440 см-1 (Рис.34а).
Модификация молекулы белка приводит к постепенному сдвигу максимума линии с 403до 420 см-1 в последовательности: нативный белок, образец с ДТТ, термически80денатурированный белок и образец с ТКЭФ. Линии в этом диапазоне относятся к колебаниямбоковой цепи.В спектре химотрипсина также наблюдаются линия на частоте 425 см-1 иплечо на частоте 403 см-1 (Рис.
34б). Можно предположить, что в спектре БСА видны те желинии, а видимый сдвиг высокочастотной линии является результатом уменьшенияинтенсивности низкочастотной компоненты этого дублета. Также как и для образцов БСА, вспектрах химотрипсина наблюдаются изменения в линиях в диапазоне 380 – 440 см-1практически в том же порядке, как и для БСА. Спектр ингибированного химотрипсина малоотличается от спектра образца с ТКЭФ.Перераспределение относительных интенсивностей также наблюдается в спектре БСАдля линий на 460 и 490 см-1. Согласно литературным данным эти линии приписываются С-С-Cизгибным и колебаниям боковой цепи, соответственно [142].
Обе линии хорошо видны тольков спектре термически денатурированного химотрипсина, а в оставшихся модифицированныхобразцах химотрипсина наблюдается только линия на 460 см-1.В спектре БСА в этом диапазоне присутствует линия на 515 см-1. По уже указаннойранее последовательностиспектров (нативныйбелок, образецс ДТТ, термическиденатурированный белок и образец с ТКЭФ) наблюдается увеличение относительнойинтенсивности линии на частоте 545 см-1. В спектре нативного БСА есть еще и линия на 565см-1, которая практически не наблюдается в спектрах остальных образцов. В обсуждаемомвысокочастотном диапазоне 500 – 600 см-1 спектр нативного химотрипсина значительноотличаетсяотспектровостальныхобразцов.Исходные,необработанныеспектрыхимотрипсина в этом же диапазоне, также показывают увеличение относительнойинтенсивности линии на 565 см-1 в спектрах модифицированных образцов, наиболееразличима эта линия в спектре ингибированного химотрипсина.Дляпроведениядополнительногоанализаизмененийбелков,связанныхсовзаимодействием с реагентами, в работе был использован метод КР спектроскопии.На Рис.
35а и Рис. 35б представлены КР спектры нативного и модифицированных образцовБСА,подвергнутыевычитаниюфоновойкомпонентыспомощьюитеративногополиномиального метода и сдвинутые по вертикальной оси друг относительно друга дляудобства анализа спектров. Обсуждаемые здесь и далее в диссертации линии отмечены нарисунке пронумерованными стрелками и упоминаются в тексте в формате (Х1, Х2,…, А1,А2,..для химотрипсина и альбумина, соответственно). Несимметричная спектральная линия начастоте около 150 см-1 (А1), предположительно состоящая из нескольких спектральныхкомпонент, наблюдается в спектрах всех образцов.
Взаимодействие с реагентами приводит кперераспределению интенсивностей компонент, вследствие чего возникают изменения вформе линии. Отметим увеличение интенсивности линии на частоте 170 см-1 (А2), которая81наиболее сильно проявляется в спектре термически денатурированного образца.
В этомобразце также присутствует слабоинтенсивная линия на частоте 190 см-1 (А3), не наблюдаемаяв спектрах остальных образцов.Линии с частотами меньше 200 см-1 в КР спектрах химотрипсина и его модификацийтакже являются чувствительными к взаимодействиям. В частности, линия нативногохимотрипсина на частоте 110 см-1 (Рис. 35в, Х1) исчезает в спектре термическиденатурированного образца и интенсивность линии на частоте 155 см-1 (Х2) уменьшается. Востальных модифицированных образцах наблюдается увеличение в интенсивности линии начастоте 175 см-1 (Х3).При сравнении спектров различных белков в главе 3 был сделан вывод о том, что линииβ-структурных белков в диапазоне до 100 – 120 см-1 смещены в низкочастотную область.
Этотвывод может быть подтвержден результатами, показанными на Рис. 35. В КР спектраххимотрипсина, β-структурного белка, наблюдается линия на частоте около 110 см-1 (Рис. 35в,Х1), отсутствующая в спектрах БСА (Рис. 35а). Ее вклад в широкую низкочастотную линиюКР спектра белка приводит к смещению центрального пика на 105 см-1 (см. Рис. 27).Термическая денатурация БСА ведет к значительным изменениям широкой линии начастоте 220 см-1 (Рис.
35а, А4): интенсивность низкочастотной компоненты уменьшается, в товремя, как интенсивность высокочастотной увеличивается. Эта линия незначительносдвигается в спектре образца с ТКЭФ и почти не меняется в образце с ДТТ. Широкая линия начастоте 235 см-1 в спектре нативного химотрипсина (Х4) превращается в дублет в спектреингибированного белка и комплекса с ТКЭФ (Х4, Х5). Также как и в случае БСА, термическаяденатурация приводит к значительному уменьшению интенсивности линии и взаимодействиес ДТТ не вызывает значительных изменений.
Термическая денатурация также вызываетсущественные изменения линии на частоте 325 см-1 в спектре БСА (А5). Взаимодействие сТКЭФ приводит к сдвигу этой линии на частоту 335 см-1 (А5), а взаимодействие с ДТТ влияетна форму этой линии (А5). Такое изменение в спектре белка может говорить также обувеличении содержания β-структур, согласно результатам главы 4, где показано, что βструктурные белки имеют линию, смещенную в высокочастотную область, на частоту около335 см-1. В спектре химотрипсина присутствует широкая линия на 335 см-1 (Рис.
35в, Х6), но сплечом на частоте 305 см-1, которое становится преобладающим в спектре ингибированногохимотрипсина (Х7). Перераспределение относительных интенсивностей спектральныхкомпонент в частотном диапазоне 300 – 370 см-1 наблюдается в спектрах термическиденатурированного образца и образца, провзаимодействовавшего с ТКЭФ. Взаимодействие сДТТ обоих белков – и химотрипсина и БСА – ведет к уменьшению общей интенсивностилинии на частоте 330 – 335 см-1.82Рис. 35.
КР спектры БСА (а,б) и химотрипсина (в,г): (I) – комплексов белок-ДТТ, (II) – нативных белков, (III) –термически денатурированных, (IV) – белок-ТКЭФ, и спектр ингибированного химотрипсина (V).Отметим, что линии на частотах 280 и 360 – 375 см-1 появляются в спектрахмодифицированных образцов. Наиболее интенсивные линии на 280 и 360 см-1 проявляются вспектре образца белок-ДТТ. Интенсивность линии на 280 см-1 также довольно высока вспектрах образцов БСА-ТКЭФ и термически денатурированного БСА.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
