Диссертация (1103978), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Каждый спектрнормирован на свою интенсивность на частоте 318 см-1. Эта частота выбрана в связи с тем, чтоона является максимумом интенсивности линии спектров α-спиральных белков. Отметим, чтоформа линии этих белков является почти симметричной, в то время как более β-структурныебелки имеют более сложную форму линии. При используемом способе нормировкиинтенсивности линий спектров на частоте 333 см-1 (максимум линии конканавалина)66практически монотонно увеличиваются с увеличением процентного содержания β-структур вбелках.
Такая зависимость представлена на вставке к рисунку.Общая тенденция в изменении формы и положения интенсивности линии для разныхбелков позволяет характеризовать вторичную структуру белка – более низкочастотная линияспектра указывает на принадлежность белка к α-спиральным белкам.Рис. 26. ИК спектры белков: (1) конканавалина, (2) химотрипсина, (3) овальбумина, (4) лизоцима, (5) БСА.Вставка: зависимость интенсивности линии спектров белков на частоте 333 см-1 от относительного содержания β структур.В диапазоне 400 – 440 см-1 во всех спектрах белков также присутствуют линии,отличающиеся друг от друга по форме и положению. Тем не менее, анализ этих линий непредставляет возможным отнести эти линии к элементам вторичной структуры, так каксоответствий изменений линий с различием во вторичной структуре белков не обнаружено.Результаты КР спектроскопии также позволили выделить несколько конформационночувствительных диапазонов низкочастотных спектров белков.67Рис.
27. КР спектры: (1) овальбумина, (2) химотрипсина, (3) конканавалина, (4) фибриногена, (5) лизоцима, (6)коллагена, (7) БСА.На Рис. 27 представлены полученные в результате обработки спектры всехисследуемых белков в диапазоне 40 – 200 см-1. Сначала для вычитания из низкочастотнойчасти спектра фонового сигнала, обусловленного рассеянием в крыле линии Рэлеяиспользован перевод данных в представление R(ν). После этого получившиеся спектрыприводились к одному фону с помощью программы метода сравнения в диапазоне 40 – 600 см1и нормировались каждый на свой интеграл в представленном на рисунке диапазоне (вданном случае это 40 – 200 см-1).Видно, что во всех спектрах присутствует широкая линия с центральным пиком около100 – 120 см-1. Два β-структурных белка, химотрипсин и конканавалин, а также овальбуминимеют почти одинаковую форму линии спектра с центральным максимумом на частоте около105 см-1 (Рис.
27а). Небольшие отличия можно заметить лишь в интенсивности линии –конканавалин, имеющий чуть меньшее содержание α-спиралей и чуть большее содержание βструктур, имеет незначительно более интенсивную линию в спектре. При этом в спектрехимотрипсина присутствует чуть более интенсивное плечо на частоте около 150 – 160 см-1.Четыре α-спиральных белка – БСА, лизоцим, фибриноген и коллаген образуют вторую группубелков, формы линий спектра которых очень похожи. Центральный пик, расположенный начастоте около 115 см-1, смещен в высокочастотную область относительно линии спектраконканавалина, и имеет меньшую интенсивность. Плечо на частоте 150 – 160 см-1 интенсивнеепроявляется в спектрах α-спиральных белков. Отметим также, что отличие формы линииколлагена может быть связано с особенностью (левоспиральностью) коллагена.68Рис.
28. КР спектры: (1) конканавалина, (2) химотрипсина, (3) лактальбумина, (4) овальбумина, (5) фибринногена,(6) лизоцима, (7) БСА, (8) человеческого альбумина, и (9) коллагена. Спектры расположены по возрастанию(снизу вверх) (а) содержания β-структурных элементов и (б) молекулярной массы белков.69Такое поведение спектров белков, образующих две группы, позволяет выдвинутьгипотезу о том, что исследуемая низкочастотная линия спектра является конформационночувствительной. Положение и форма линии позволяют провести сравнение содержанияэлементов вторичной структуры белков.На Рис.
28 представлен следующий конформационно чувствительный диапазон.Показанные спектры также являются результатом обработки экспериментальных данных.Аналогично тому, как это было сделано для представления результатов на предыдущемрисунке, проведена последовательная обработка спектров несколькими методами длядостижения наиболее показательного представления спектральных различий. В процессеобработки применялся метод фильтра катящегося колеса и последующая нормировка наинтегральную интенсивность в интервале 180 – 470 см-1.Спектры смещены друг относительно друга для удобства сравнения в порядкеувеличения содержания α-спиралей (Рис.
28а) и уменьшения β-структур (Рис. 28б) сверхувниз. Можно заметить некоторые различия между представленными белками, такие каксмещение центральной частоты линии в диапазоне 200 – 270 см-1 – смещение происходит внизкочастотную область вместе с уменьшением содержания α-спиралей. Тем не менее, естьряд белков, выпадающих из этой тенденции – овальбумин, лизоцим, коллаген.
Так же можноотметить наличие линии на частоте в диапазоне 280 – 350 см-1 в спектрах всех белков, приэтом все же претерпевающую смещение, которое нет возможности соотнести с разницей вовторичной структуре белка, как и с другими различающимися свойствами белков, например ихразмером. Такой же вывод можно сделать об изменениях в форме, амплитуде и положениилинии спектров в диапазоне 390 – 440 см-1.Таким образом, за исключением наличия небольших общих сдвигов в низкочастотныхКР спектрах белков в диапазоне 180 – 470 см-1 не получается найти корреляций междуспектральнымиразличиямиисодержаниемэлементоввторичнойструктурыилимолекулярным весом исследуемых белков.Известно, что низкочастотные линии спектров могут быть приписаны к скелетнымколебаниям молекул или колебаниям идентичных фрагментов различных аминокислот.Следовательно, низкочастотные спектры не должны быть чувствительны к вариациям ваминокислотном составе белков.
Тем не менее, как видно из Рис. 28, наблюдаютсязначительно отличающиеся друг от друга низкочастотные КР спектры белков. Спектральныелинии едва ли могут быть соотнесены с согласованными колебаниям больших фрагментовмолекул или субглобулярными колебаниями в связи с отсутствием зависимостей междуспектральными изменениями и молекулярным весом белков. В то же время, наблюдаемые70различия КР спектров не могут быть интерпретированы с использованием различий всодержании элементов вторичной структуры.
В связи с этим можно предположить, чтоотличия спектров белков могут быть связаны с различиями в третичной и (или) четвертичнойструктурах молекул.Рис. 29. ИК спектры (1) фибриногена, (2) коллагена и (3) химотрипсина.ПроведеносравнениеИКиКРспектровглобуярныхинеглобулярных(суперспиральных) белков. На Рис. 29 представлен исследуемый низкочастотный интервал ИКспектров неглобулярных белков коллагена и фибриногена, а так же глобулярного белкахимотрипсина. Показанные спектры являются результатом применения метода сравнения,который позволил выровнять фоновые сигналы. Как видно из рисунка, в спектрах коллагена ифибриногена присутствуют интенсивные линии, которые отсутствуют в спектрах всехостальных исследуемых белков (на рисунке представлен только спектр химотрипсина длясравнения).
Результаты КР спектроскопии показывают (Рис. 28), что спектры неглобулярных(суперспиральных) белков – фибриногена и коллагена – в целом отличаются от спектровглобулярных белков, хотя спектр овальбумина близок к спектру фибриногена.Как известно, линии амид, используемые для определения содержания элементоввторичной структуры, преобладают в ИК спектрах белков в диапазоне «отпечатков пальцев».И лишь только линии амид I и амид III наблюдаются в КР спектрах белков.
Тем не менее, КР71спектры содержат множество других линий колебаний, отнесенных к колебаниям одиночныхаминокислот или групп атомов, что позволяет получать дополнительную информацию обисследуемом объекте. Соотнесение полученных в работе результатов низкочастотнойспектроскопии с результатами в диапазоне «отпечатков пальцев» позволяет утверждать, чтоособенности этих двух техник спектроскопии обнаруживаются и в низкочастотном диапазоне,так как именно результаты ИК спектроскопии позволяют найти зависимости междуспектральными различиями и содержанием элементов вторичной структуры молекул.Заключение к главе 4Анализ низкочастотных ИК и КР спектров белков с сильно различающейся вторичнойструктурой позволил выделить несколько конформационно чувствительных диапазонов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
