Диссертация (1103978), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Для проведения ИК-Фурье экспериментов в конфигурации на пропускание60лиофилизованные порошки прессовались в таблетки с массами от 2,5 до 10 мг и толщинойоколо 200 мкм, в зависимости от того, какое количество порошка необходимо дляприготовления механически стабильных образцов.§2. Контрольные измерения в диапазоне «отпечатков пальцев»Сравнение линий амид I и амид III нескольких исследуемых белков с различнойвторичной структурой позволяет провести качественный контроль исследуемых образцов.Рис. 21.
КР спектры белков с различной вторичной структурой: 1 – лактальбумин, 2 – конканавалин, 3 –химотрипсин, 4 – овальбумин, 5 – фибриноген, 6 – лизоцим, 7 – БСА в диапазоне линии амид I.На Рис. 21 представлен диапазон линии амид I КР спектра белков с различнойвторичной структурой. Показанные на рисунке спектры являются результатом обработкиисходных экспериментальных данных. Сначала спектры приводились к общему фону спомощью метода сравнения, далее из спектра был выделен диапазон 1135 – 1730 см-1.
Из всехспектров в этом диапазоне с применением фильтра катящегося колеса вычитался оставшийсявклад фоновой компоненты, после чего была проведена нормировка на интеграл под линиейамид I.61Согласно существующим базам данных, α-спиральные элементы имеют линии вдиапазоне частот 1643 – 1655 см-1, β-листы в диапазоне 1670 – 1690 см-1, и неупорядоченныеструктуры около 1655 – 1665 см-1 и около 1690 см-1 [130, 131, 132, 133].Как видно из Рис.
21, спектр БСА имеет наиболее смещенный в низкочастотнуюобласть пик линии амид I – на частоте около 1655 см-1. В соответствии с Таблица 4 молекулаБСА не содержит β-структурных элементов и почти на 60 % α-спирализована. Пик линии амидI в спектре другого α-спирального белка (лизоцима) смещен в высокочастотную областьотносительно линии спектра БСА.
Далее идут три белка, пики линии амид I у которыхнаходятся примерно на одной и той же частоте – это фибриноген, овальбумин и лактальбумин.Наибольшее высокочастотное смещение линии наблюдается в спектрах химотрипсина иконканавалина. Такая последовательность спектров белков соответствует уменьшениюсодержания α-спиральных элементов в их структуре (см. Таблица 4).Рис. 22. КР спектры белков с различной вторичной структурой: 1 – БСА, 2 – лизоцим, 3 – фибриноген, 4 –овальбумин, 5 – лактальбумин, 6 – химотрипсин, 7 – конканавалин в диапазоне линии амид III.На Рис.
22 представлены спектры исследуемых белков в диапазоне линии амид III.Отметим последовательность с тенденцией к уменьшению интенсивности линии на частоте1235 см-1: конканавалин – химотрипсин - лактальбумин – овальбумин – фибриноген – лизоцим62– БСА. Согласно литературным данным, эта линия соответствует β-структурным элементамвторичной структуры белка. Интенсивность линии на частоте 1310 см-1 уменьшается впоследовательности: БСА – лизоцим – фибриноген – овальбумин – лактальбумин –химотрипсин – лизоцим.
Эта линия относится к α-спиральным элементам, что также находитсяв соответствии с содержанием этих компонент в структуре выбранных белков.§3. Сравнительный анализ низкочастотных колебательных спектров несколькихбелковОбработка полученных результатов проводилась при помощи нескольких процедур.Для вычитания фона применялись фильтр бегущего колеса [134] и метод сравнения спектров[135]. Низкочастотные КР спектры дополнительно переводились в R(ν) представление [136],позволяющее избавиться от низкочастотного фона, вызванного рэлеевским рассеянием. Длясравненияипредставлениярезультатоввнекоторыхслучаяхприменялисьметодпоследовательного двойного дифференцирования и интегрирования, позволяющий избавитьсяот линейного фона, и нормировка спектров на максимум линии спектра или на его интеграл вопределенном диапазоне.
Набор методов и параметров обработки спектров в каждомисследуемом диапазоне индивидуальный. Выбор той или иной схемы обработки объясняетсянеобходимостью наиболее наглядно представить описываемые спектральные изменения, атакжеизбежатьнеправомерногоискажениярезультатов.Примеррезультатапоследовательного применения методов обработки к КР спектрам представлен на Рис. 23.63Рис. 23. Пример обработки экспериментальных КР спектров: (б) перевод в представление R(ν), и вычитание фона(в) методом катящегося колеса и (г) полиномиальным итерационным методом.Эксперименты по ИК-Фурье спектроскопии позволили выделить в низкочастотномдиапазоне спектров белков три участка, характер различий в которых позволяет назвать ихконформационно чувствительными.На Рис. 24 представлены ИК-Фурье спектры исследуемых белков в диапазоне 70 – 200см-1.
Представленные спектры являются результатом последовательной обработки. Сначалавсе спектры приводили к общему фону в диапазоне 70 – 600 см-1, применяя метод сравнения,принцип которого описан в §2 главы 2 и в работе [94]. После этого проводилось вычитаниелинейного фонового сигнала в диапазоне 70 – 200 см-1. Далее спектры нормировались намаксимум линии в этом диапазоне. Здесь и далее все спектры являются результатомусреднения, ошибка измерения составляет 5 – 7%.
На вставке представлены измеренные, необработанные спектры α-спирального (БСА) и β-структурного (конканавалина) белков.Спектр фибриногена не приведен на рисунке, так как в этой области в нем присутствуетинтенсивная линия, которая мешает анализу результатов. Видно, что формы спектровразличаются. По этому признаку можно разделить белки на две группы – БСА и лизоцим, вспектрах которых есть высокочастотное плечо, и конканавалин, химотрипсин и овальбумин,64форма линий которых не имеет такой особенности.
Центральные пики двух β-структурныхбелков конканавалина и химотрипсина лежат на более низких частотах, чем у α-спиральныхлизоцима и БСА. Следовательно, более низкочастотный пик линии на 100 – 150 см-1 можетсвидетельствовать о большем содержании β-структур в белке, или, иначе говоря, наличиеболее интенсивного плеча линии на частоте около 150 см-1 может говорить о большей степениα-спиральности белка. Тем не менее, процентное содержание элементов вторичной структурыбелков не может быть получено исходя из разницы интенсивностей линий спектра в этоминтервале.Рис.
24. ИК спектры белков: (1) лизоцим, (2) БСА, (3) химотрипсин, (4) овальбумин, (5) конканавалин. Вставка:Измеренные ИК спектры БСА (треугольники) и конканаваина (сплошная линия) без обработки.На Рис. 25 представлены спектры белков в диапазоне 200 – 280 см-1. Обработкаприведенных на рисунке спектров проводилась по следующей схеме. Сначала спектрыприводились к одному фону с помощью метода сравнения, после чего применялся методывычитания фона – фильтр бегущего колеса. Форма и положение линий в этом диапазоне такжеотличаются. Можно проследить тенденцию к уменьшению интенсивности линии в диапазоне220 – 260 см-1 по последовательности конканавалин – химотрипсин – овальбумин – лизоцим –БСА от интенсивной до почти неразличимой.
При этом положение этой линии также меняется.На вставке представлены значения пиковых интенсивностей линии (соответствующих разным65частотам) и интегральных интенсивностей линии в зависимости от содержания β-структурныхэлементов в белке. Обе полученные интенсивности имеют тенденцию к увеличению сувеличением процентного содержания β-структур. Опираясь на эту закономерность, возможносделать предположение о том, что представленная линия в диапазоне 220 – 260 см-1 внизкочастотном ИК-спектре белка может соответствовать колебаниям β-структурныхкомпонент молекулы. Значительная разница в интенсивности линии конканавалина от другихбелков может быть связана с почти нулевым содержанием в нем α-спиральных фрагментов иотсутствием дисульфидных связей.Рис.
25. ИК спектры белков: (1) конканавалин, (2) химотрипсин, (3) овальбумин, (4) лизоцим, (5) БСА. Вставка:значения интенсивностей линии, нормированных на максимум (квадраты) и на интегральную сумму (круги), взависимости от содержаня β-структур представленных на рисунке белков.На Рис. 26 представлен третий спектральный диапазон 275 – 375 см-1. Обработкаспектров проводилась по аналогичной предыдущему рисунку схеме.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
