Диссертация (1103978), страница 12
Текст из файла (страница 12)
В образце 1:250 расстояние между молекулами белка составляетпримерно 20% от размера белковой глобулы. Сопоставление размеров молекул крауна и белкаb4CHA.pdb53позволяет предположить, что между молекулами белка находится 2 – 3 слоя молекул крауна.Следовательно, возможно взаимодействие не только между белком и крауном, но ивзаимодействие молекул крауна между собой.Рис.
19. ТГц спектры (1) комплексов химотрипсин-краун с относительными концентрациями 1:250 (а) и 1:100 (б),а также рассчитанные исходя из концентрации компонент спектры (2).Предположим, что разница в спектрах образцов 1:100 и 1:250 обусловленадополнительным содержанием крауна в последнем образце. То есть образец 1:250представляет собой аддитивную смесь образца 1:100 и крауна.
Тогда спектр образца 1:250должен быть идентичен линейной комбинации спектров образца 1:100 и крауна ссоответствующими весовыми коэффициентами (с учетом отсутствия свободных молекул белкав образце 1:250 так, что концентрация частиц образца 1:100 в образце 1:250 соответствуетконцентрации молекул белка). На Рис. 20 представлены рассчитанный таким образом иизмеренный спектры.54Рис. 20. ТГц спектры (1) комплекса химотрипсин-краун 1:250 и (2) спектра, рассчитанного из суперпозицииспектров комплекса 1:100 и чистого крауна.Видно, что формы спектров различаются и значения оптической плотностирассчитанного спектра в целом меньше, чем для измеренного.
Следовательно, излишниемолекулы крауна в образце 1:250 должны быть вовлечены во взаимодействие с молекулойбелка и/или вызывать изменения в гетерогенной системе химотрипсин-краун.Заключение к главе 31. В ходе исследования взаимодействия молекул белка с краун-эфиром измеренынизкочастотные ИК и ТГц спектры белка α-химотрипсина. Также измерены спектрыкраун-эфира18-краун-6,модельногосоединениятриса,имитирующегоповерхностные аминогруппы белка, и смесей химотрипсина и триса с краунэфиром.2.
Анализ результатов, полученных в результате экспериментов,позволяетохарактеризовать взаимодействие непротонированной и протонированной формтриса с крауном:a.Протонированный трис активнее взаимодействует с крауном по сравнению снепротонированным.b. В спектрах смеси протонированный трис-краун с молярной концентрацией1:1 появляются дополнительные линии, наблюдается уменьшение линий55спектровкомпонент,чтоговоритоформированиистабильногоэквимолярного комплекса протонированных аминогрупп триса с крауном.c. Непротонированные аминогруппы триса слабо взаимодействуют с крауном.ТГц спектры показывают практически отсутствие взаимодействия междумолекулами в связи с отсутствием изменений в спектрах комплексов посравнению со спектрами чистых веществ, в то время как ИК спектрыкомплексов незначительно меняются.
Предполагается, что лиофилизованнаясмесьнепротонированноготрисаикраунапредставляетсобоймикрокристаллы чистых веществ (триса и крауна), которые взаимодействуютдруг с другом на границах этих микрокристаллов, за счет чего и возникаютизменения в ИК спектрах.3. Все экспериментально полученные результаты качественно согласуются с даннымирасчетовколебательныхмодтриса,краунаиэлементарнойячейкиихэквимолярного комплекса.4. Проведено измерение ТГц и ИК спектров поглощения химотрипсина и смесейхимотрипсин-краун при различных концентрационных соотношениях компонент.Спектр химотрипсина в низкочастотном диапазоне не имеет спектральныхособенностей, за исключением трех слабых линий на частотах около 131, 154 и 234см-1.
В спектрах же смесей химотрипсин-краун присутствуют выраженные линии.При этом спектры смесей значительно отличаются от спектров их компонент.Проведенный анализ показывает, что спектры смесей химотрипсин – краун всоотношениях 1:100 и 1:250 не могут быть представлены в виде суперпозицииспектров чистых веществ, также и спектр смеси 1:250 не представляет собой суммуспектров смеси 1:100 и крауна.5. Изменения, происходящие со спектрами смесей при взаимодействии химотриспинас крауном при увеличении концентрации крауна очень похожи по характеру наизменения спектров смесей при взаимодействии протонированного триса с крауном.Основываясь на результатах проведенных экспериментов можно сделать вывод, чтовзаимодействие протонированных аминогрупп белка с краун-эфиром отвечает заэффект увеличения функциональной активности химотрипсина в органическомрастворителе.56Глава 4 Низкочастотная ИК-Фурье и КР спектроскопия белков с различнымсодержанием элементов вторичной структурыСоздание базы данных с соотнесением линий низкочастотного спектра белка ссоответствующими им типами колебаний – одна из задач современной науки.
На текущиймомент литературные данные от разных источников часто отличаются, либо представляютсобой перечень нескольких общих типов колебаний, которым соответствует одна и та жечастота. Обобщение существующих приписок на основании литературных данных ИК [107,108,109,110,111] КР [112, 113] представлено в Таблица 3.Таблица 3. Соответствие частот линий в ИК и КР спектрах типам колебаний.ИК спектроскопияЧастота, см-1150159 – 168Тип колебанияNH изгибные колебания, колебания кристаллическойрешеткиN-H внеплоскостные колебания, C-N торсионныеколебания, C=O внеплоскостные колебания200200Амид VIIN-H внеплоскостные колебания, C-N торсионныеколебания, C=O внеплоскостные колебания238Метил торсионные колебания248C-C-C изгибные колебания286300320321 – 328384C-CN деформационные колебания, N-C торсионныеколебанияC-N-C деформационные колебания, C=O плоскостныеколебания, C-C-N деформационные колебанияC-C-C изгибные колебанияC-N-C деформационные колебания, C=O плоскостныеколебания, C-C-N деформационные колебанияC-C-N деформационные колебания, C=O плоскостныеколебания, C-N валентные колебания362Колебания α-спиралей390 – 400Колебания боковой цепи405 – 409C-C-N деформационные колебания, C=O плоскостные57колебания, C-N валентные колебания415 – 425425437Колебания боковой цепиC-C-N деформационные колебания, C=O плоскостныеколебания, C-N валентные колебанияC-C-N деформационные колебания, C=O плоскостныеколебания, C-N валентные колебания454 – 460C-C-C изгибные колебания468Колебания боковой цепи490Колебания боковой цепи537 – 606Амид VI, внеплоскостные C=O изгибные колебания549 – 555C=O плоскостные колебания603 – 620C=O внеплоскостные колебания, C-N торсионныеколебания625 – 767Амид IV, OCN изгибные колебания640 – 800Амид V, внеплоскостные NH изгибные колебания675Амид IV, Амид VI676 – 690C=O изгибные колебания, C-C (метил-) валентныеколебания, C-N-C деформационные колебанияКР спектроскопияЧастота, см-125 – 30Тип колебанияКолебания большой части белка, межмолекулярныеколебания75Торсионные колебания112OH валентные колебания135NH внеплоскостные изгибные колебания, COвнеплоскостные изгибные колебанияNH внеплоскостные изгибные колебания, CNC159деформационные колебания, NCC деформационныеколебания160Изгибные колебанияCNC деформационные колебания, CCN165деформационные колебания, NH внеплоскостныеизгибные колебания170NH внеплоскостные изгибные колебания, CO58внеплоскостные изгибные колебания185CNC деформационные колебания211CNC деформационные колебания235СС торсионные колебания, NCC колебанияCNC деформационные колебания, C=O плоскостные260изгибные колебания, NH внеплоскостные изгибныеколебанияNCC деформационные колебания, NH внеплоскостные327изгибные колебания, C=O плоскостные изгибныеколебания332NCC колебания437NCC колебания510SS колебания (гош-гош-гош конформация)525SS колебания (гош-гош-транс конформация)540SS колебания (транс-гош-транс конформация)566CO внеплоскостные изгибные колебанияC=O внеплоскостные изгибные колебания, C=O589плоскостные изгибные колебания, CC валентныеколебанияИз-заограничений,накладываемыхразмерамимолекулбелковпроводитьтеоретические расчеты колебательного спектра белка довольно затруднительно.
Основнойметод, применяемый для проведения приписок линий – вычисление спектра исследуемогообъекта по спектрам модельных соединений, представляющих собой те или иныефункциональныегруппыисходноймолекулы.Ещеодинсуществующийметод,экспериментальный, – сравнение спектров белков, находящихся в заведомо разных, известныхсостояниях.§1. Экспериментальные образцыВ работе проводилось измерение низкочастотных ИК и КР спектров нескольких белков.В экспериментах использовались химотрипсин («Самсон Мед»), бычий сывороточныйальбумин (БСА) («MP Biomedicals», CAS 9048-46-8), лизоцим («MP Biomedicals», CAS 900163-2), конканавалин («MP Biomedicals», CAS 11028-71-0), лактальбумин («MP Biomedicals»,CAS 9013-90-5), коллаген («MP Biomedicals», CAS 9007-34-5), овальбумин («Worthington»,59CAS 9006-59-1), фибриноген («Sigma», CAS 9001-32-5) и человеческий сывороточныйальбумин («Sigma», CAS 70024-90-7).
Эти белки в нативном состоянии имеют различноесодержание элементов вторичной структуры – химотрипсин и конканавалин являются βструктурными белками, альбумины и лизоцим α-спиральными, овальбумин, лактальбумин ифибриноген занимают промежуточное положение, имея в своем составе как α-, так и βструктуры. Коллаген является полностью спиральным белком, причем закручены спирали, вотличие от остальных исследуемых белков, в левую сторону. В Таблица 4 ниже приведеныусредненные по нескольким источникам данные о процентном содержании элементовструктуры исследуемых белков. Отметим также, что фибриноген и коллаген отличаются отостальныхбелковтем,чтомогутбытьклассифицированыкаксуперспиральные,неглобулярные белки.Таблица 4.
Содержание элементов вторичной структуры исследуемых белков.α-спирали,β-листы,Неупорядоченные%%структуры, %Конканавалин26533Химотрипсин85042Лактальбумин293041[119, 120]14,2Овальбумин313237[121]45Фибриноген402040[122,123]340Лизоцим4820325704362038[127,128]66,500129300БелокБычийсывороточныйальбуминИсточники[114,115][115,116,117,118][114,115,117,118,124][117,118,125,126]Молекулярнаямасса, кДа1022514,569Человеческийсывороточныйальбумин100Коллаген(левосторонние α спирали)Для экспериментов по КР спектроскопии использовались лиофилизованные порошкибелков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
