Автореферат (1103977), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Так, например, трис(2-карбоксэтил)фосфин (ТКЭФ) идитиотреитол (ДТТ) приводят к разрыву дисульфидных связей, что существенно влияет наструктуру молекулы, так как именно дисульфидные мостики участвуют в создании иудержании определенной пространственной структуры белка.16Проведены эксперименты по низкочастотной ИК-Фурье и КР спектроскопии двухбелков (химотрипсина и БСА), а также образцов этих белков, модифицированных врезультате взаимодействия с ТКЭФ и ДТТ и термической денатурации.
Состояниедисульфидных связей белков контролировалось по относительным интенсивностям линийКР спектра в интервале 500 – 550 см-1.Дополнительно проводилось исследование ингибированного химотрипсина. Образцыпредставляли собой таблетки, спрессованные из лиофилизованных порошков.Анализ полученных данных показывает, что все применяемые факторы денатурацииприводят к изменениям в низкочастотных ИК-Фурье и КР спектрах белков.Так, при модифицировании химотрипсина значительно изменяются ИК-Фурьеспектры в диапазоне 70 – 200 см-1.
Если в нативном состоянии у химотрипсина центральныйпик в указанном диапазоне расположен на частоте около 115 см-1, то при термическойобработке белка происходит высокочастотное смещение этого пика и увеличениеинтенсивности плеча на частоте около 140 – 150 см-1. Разрыв дисульфидных мостиковприводит к чуть менее значительным изменениям в форме спектра в этом диапазоне, но вцелом тенденция к смещению линии в высокочастотную область и появлению плеча у линииналицо.
В ИК-Фурье спектрах модифицированных образцов наблюдается увеличениеинтенсивности линии в диапазоне 200 – 280 см-1 и уменьшение интенсивностинизкочастотной компоненты дублета в диапазоне 380 – 440 см-1.Значительные изменения происходят и в КР спектрах. Так, например, в результатетермической денатурации исчезает линия нативного белка на частоте 110 см-1. Широкаялиния, наблюдаемая в спектре нативного белка в интервале 220 – 260 см-1 преобразуется вдублет вследствие взаимодействия с ТКЭФ и термической денатурации.Молекула БСА (α-спирального белка) более устойчива по отношению к применяемымвоздействиям, на что указывают менее заметные изменения ИК-Фурье спектров в диапазонедо 200 см-1.
Тем не менее, как и для химотрипсина, в более высокочастотном диапазоне вспектрах БСА присутствуют конформационно-чувствительные линии. В частности, вспектрах модифицированных образцов наблюдается увеличение интенсивности линии вдиапазоне 200 – 280 см-1. Модификация молекулы белка приводит к постепенномувысокочастотному сдвигу максимума несимметричной линии нативного БСА в диапазоне370 – 440 см-1 примерно на 20 см-1.Разрыв дисульфидных связей и термическая денатурация приводят к существеннымизменениям относительных интенсивностей спектральных компонент в интервале 100 – 200см-1 в КР спектрах БСА.
Термическая денатурация также вызывает уменьшение17интенсивности низкочастотной компоненты линии с центральной частотой 325 см-1, авзаимодействие с ТКЭФ приводит к сдвигу этой линии в высокочастотную область.Экспериментальные результаты свидетельствуют о существенном влиянии факторовденатурации белков на их низкочастотные колебательные спектры. Следовательно, этотдиапазон является конформационно-чувствительным. Влияние термической денатурации наспектры белков значительнее влияния разрыва дисульфидных связей. Сравнение КРспектров белков в диапазоне 500 – 550 см-1 позволяет сделать вывод, что химотрипсин болеестабилен, чем БСА по отношению к агентам, вызывающим разрыв дисульфидных связей.Используя результаты главы 4, можно сделать вывод, что термическая денатурацияприводит к некоторому увеличению спиральности молекулы химотрипсина, а разрывдисульфидных мостиков и термическая денатурация ведут к образованию β-структурныхфрагментов в БСА.Ингибирование химотрипсина также приводит к изменениям в его низкочастотныхИК и КР спектрах.
Например, происходит высокочастотное смещение линии ИК спектра вдиапазоне 70 – 200 см-1, заметно увеличение интенсивности линии на частоте около 565 см-1.В целом, ИК спектр ингибированного белка в диапазоне 380 – 600 см-1 похож на спектрбелка,модифицированноговзаимодействиемсТКЭФ.Изменения вКРспектреингибированного химотрипсина в спектральном диапазоне 220 – 280 см-1 аналогичныизменениям в спектре белка с разорванными дисульфидными связями.В заключении сформулированы основные результаты и выводы диссертационнойработы, а также положения, выносимые на защиту.Основные результаты и выводы1. Впервые измерены спектры терагерцового поглощения и низкочастотные ИК-Фурьеспектры лиофилизованных смесей химотрипсин-краун.
Выявлено их значительноеотличие от спектров чистых веществ, что свидетельствует о существенноммежмолекулярном взаимодействии при преимущественном взаимодействии краунэфира с протонированными аминогруппами.2. Выявлены отличия низкочастотных колебательных спектров восьмиобъясняющиесяотличиямивторичныхструктур(например,белков,увеличениеинтенсивности в полосе 130 – 190 см-1 для α-спиральных белков, как в ИК-Фурье, таки в КР спектрах и монотонное увеличение интенсивностей в диапазоне 220 – 260 см-1и на частоте 333 см-1 в ИК-Фурье спектрах белков с увеличением содержания βструктур).183.
Установлено, что низкочастотные ИК-Фурье спектры суперспиральных белков(фибриногена и коллагена) существенно отличаются от спектров глобулярных белков.4. Отсутствие корреляций значительных изменений в низкочастотных КР спектрахбелков в диапазоне 200 – 470 см-1 с содержанием элементов вторичной структурыи/или молекулярным весом и неспецифичность колебаний этого диапазона поотношению к отдельным аминокислотным остаткам позволяют предположить связьспектральных изменений с различиями в третичной и/или четвертичной структурахмолекул.5.
Разрыв дисульфидных мостиков в молекуле белка и термическая денатурацияприводят к существенным изменениям в низкочастотных колебательных спектрах(например,увеличениюинтенсивностивдиапазоне200–280см-1иперераспределению интенсивностей в полосе 370 – 440 см-1 ИК-Фурье спектров,перераспределению интенсивностей в интервале 100 – 200 см-1 КР спектров,высокочастотному сдвигу линии 325 см-1 в КР спектрах БСА и образованию дублета винтервале 220 – 260 см-1 в КР спектрах химотрипсина).6.
Выявлено,чтоингибированиехимотрипсинанизкочастотныхколебательныхспектрах,приводитксопоставимымизменениямсвизменениями,вызываемыми термической денатурацией (высокочастотным сдвигам и изменениямотносительных интенсивностей линий).Длякаждогоизэкспериментовудалосьподобратьоптимальнуюметодикуприготовления образцов, позволяющую получать достоверные результаты.
Для каждогоспектральногодиапазонаподобраноптимальныйнаборметодовобработкиэкспериментальных данных, не искажающих результаты и позволяющих провести наиболеенаглядное сравнение спектров. В результате применения этих методов удалось выявитьнесколько конформационно-чувствительных диапазонов в низкочастотных ИК-Фурье и КРспектрах белков. Взаимодействие белка (химотрипсина) с молекулами краун-эфира (вчастности, взаимодействие поверхностных аминогрупп белка) приводит к значительнымизменениям в низкочастотных колебательных спектрах.
Таким образом, поставленные вработе задачи решены. Достигнута и цель работы – определены изменения в низкочастотныхколебательныхспектрах,соответствующиеизменениям молекул белков.19функционально-значимымструктурнымПубликации автора по теме диссертацииСтатьи1. Cherkasova O.P. Vibrational spectra of corticosteroid hormones in THz range / O.P.Cherkasova, M.M. Nazarov, D. Sapozhnikov, A.A. Mankova, E.V.
Fedulova, V.A.Volodin, V.A. Minaeva, B.F. Minaev, G.V. Baryshnikov // Proc. SPIE. – 2010. – Т. 7376-7.– С. 73760P-1 - 73760P-5.2. Cherkasova O.P. Low-frequency vibrational spectra of testosterone, estradiol and estriol /O.P. Cherkasova, M.M. Nazarov, A.A. Mankova, E.V. Fedulova, A.P. Shkurinov, V.A.Volodin, V.A. Minaeva, B.F. Minaev, G.V. Baryshnikov // Вестник ЧеркасскогоУниверситета, Серия "Химические науки".
– 2010. – Т. 175 – С. 28-33.3. Брандт Н.Н. ИК спектроскопия структурных изменений α-химотрипсина, связанных сизменением функции в органических растворителях / Н.Н. Брандт, А.А. Манькова,А.Ю. Чикишев // ВМУ серия 3. Физика и астрономия. – 2011. – Т. 3. – С.
79-82.4. Brandt N.N. THz and IR Spectroscopy of Molecular Systems That Simulate FunctionRelated Structural Changes of Proteins / N.N. Brandt, A.Yu. Chikishev, A.A. Mankova,M.M. Nazarov, I.K. Sakodynskaya, A.P. Shkurinov // Spectroscopy: An InternationalJournal. – 2012. – Т. 27 – № 5-6 – С. 429-432.5. Borodin A.V. Terahertz time-domain and FTIR spectroscopy of tris-crown interaction /A.V.
Borodin, A.A. Mankova, A.V. Kargovsky, N.N. Brandt, I. Kuritsyn, Q. Luo, I.K.Sakodynskaya, K. Wang, H. Zhao, A.Yu. Chikishev, A.P. Shkurinov, X.-C Zhang //Chemical Physics Letters. – 2012. – Т. 554 – С. 201-207.6. Mankova A.A. Terahertz time-domain and FTIR spectroscopic study of interaction of achymotrypsin and protonated tris with 18-crown-6 / A.A. Mankova, A.V.
Borodin, A.V.Kargovsky, N.N. Brandt, Q. Luo, I.K. Sakodynskaya, K. Wang, H. Zhao, A.Yu. Chikishev,A.P. Shkurinov, X.-C. Zhang // Chemical Physics Letters. – 2013. – Т. 560 – С. 55-59.7. Brandt N.N. FTIR, THz, and Raman spectroscopy of chymotrypsin: effect of interactionwith crown ether and denaturation / N.N. Brandt, A.Yu. Chikishev, A.P.
Shkurinov, A.A.Mankova, I.K. Sakodynskaya. // Biomedical spectroscopy and imaging. – 2014. – Т. 3 – С.219-224.8. Brandt N.N. Effect of thermal denaturation, inhibition, and cleavage of disulfide bonds onthe low-frequency Raman and FTIR spectra of chymotrypsin and albumin / N.N. Brandt,A.Yu Chikishev, A.A. Mankova, I.K. Sakodynskaya // Journal of Biomedical Optics.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
