Автореферат (1103977), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Наличиетаких значительных изменений указывает на возникновение сильного взаимодействия междукомпонентами смеси, то есть об образовании комплекса. При этом можно отметитьотсутствие в спектре комплекса линий чистого триса, что указывает на отсутствиесвободного триса в комплексе.При проведении экспериментов по ИК-Фурье спектроскопии этих же образцов вдиапазоне «отпечатков пальцев» получены аналогичные результаты. В спектре чистого трисаприсутствуют линии, которые исчезают при комплексообразовании. Вместо них появляетсяновая линия, амплитуда которой увеличивается вместе с относительной концентрациейкрауна в комплексе.
В спектре чистого крауна эта линия отсутствует. По-видимому, привзаимодействии молекул протонированного триса и крауна в соотношении 1:1 происходиткомплексообразование. При дальнейшем увеличении концентрации крауна происходитпреобразование получившегося комплекса.Результаты исследования модельного соединения указывают на то, что увеличениеактивности белка при взаимодействии с краун-эфиром обусловлено взаимодействиемименно с протонированными поверхностными аминогруппами белка. Были также проведеныэксперименты по измерению ИК и ТГц спектров комплексов белка химотрипсина с крауном.11На Рис.
2 представлены ТГц и ИК-Фурье спектры химотриспина, крауна и комплексовхимотрипсин-краун с различными относительными концентрациями.Рис. 2. ТГц (а-г) и ИК (а’–г’) спектры белка α-химотрипсин (а, а’), комплексов химотрипсин-краун 1:100 (б, б’),1:250 (в, в’) и спектры чистого крауна (г, г’).Химотрипсин не имеет ярко выраженных линий в исследуемом диапазоне и формаспектров комплексов 1:100 и 1:250 близка к (но не идентична) форме спектра чистогокрауна. Количественный анализ экспериментальных данных с учетом измеренных значенийкоэффициентов поглощения показал, что спектры комплексов не являются суперпозициямиспектровчистыхвеществ.Следовательно,можнопредположить,чтопроисходитвзаимодействие белка и крауна, которое, вероятно, ведет к связыванию крауна. Спектркомплекса 1:250 не может быть представлен в виде линейной комбинации спектров чистогокрауна и комплекса 1:100.
Оценки показывают, что в образце 1:250 возможновзаимодействие не только между белком и крауном, но и взаимодействие молекул краунамежду собой. Отметим, что исследуемые в работе образцы содержат избыточное количествомолекул крауна по отношению к числу возможных центров связывания на поверхностибелка.12Глава четыре посвящена сравнительному анализу низкочастотных ИК-Фурье и КРспектров белков с различной вторичной структурой.Создание базы данных с соотнесением линий низкочастотного спектра белка и модколебаний – одна из задач современной спектроскопии. На текущий момент данные разныхисточников часто отличаются (иногда противоречат друг другу), либо представляют собойперечень нескольких общих типов колебаний, которым соответствует одна и та же частота.Из-за ограничений, накладываемых размерами молекул, проведение теоретическихрасчетов колебательного спектра белка довольно затруднительно.
В работе использованэкспериментальный метод – сравнение спектров белков, имеющих заведомо разнуювторичную структуру.Проведено измерение низкочастотных ИК-Фурье и КР спектров несколькихлиофилизованных белков: химотрипсина, бычьего сывороточного альбумина (БСА),лизоцима, конканавалина, лактальбумина, коллагена, овальбумина, и фибриногена. Этибелки в нативном состоянии имеют различное содержание элементов вторичной структуры –химотрипсин и конканавалин содержат преимущественно β-структурные элементы, в БСА илизоциме превалируют α-спирали, овальбумин, лактальбумин и фибриноген занимаютпромежуточное положение, имея в своем составе как α-спирали, так и β-структуры.
Коллагенявляется полностью спиральным белком, причем закручены спирали, в отличие от остальныхисследуемых белков, в левую сторону. Отметим также, что фибриноген и коллагенотличаютсяотостальныхбелковтем,чтомогутбытьклассифицированыкаксуперспиральные (неглобулярные) белки.ИК-Фурье эксперименты позволили выделить в низкочастотном диапазоне спектровбелков три участка, характер различий в которых позволяет назвать их конформационночувствительными.Первый из выделенных диапазонов – 70 – 200 см-1. По форме спектров можноразделить белки на две группы – БСА и лизоцим, в спектрах которых есть высокочастотноеплечо, и конканавалин, химотрипсин и овальбумин, форма линий которых не имеет такихярко выраженных особенностей.
Сопоставление с данными по структуре белков позволяетутверждать, что наличие более интенсивного плеча линии на частоте около 150 см-1 можетговорить о большей степени спиральности структуры белка. Тем не менее, процентноесодержание элементов вторичной структуры белков не может быть получено исходя изразницы интенсивностей линий спектра в этом интервале.13Рис. 3. ИК спектры (1) конканавалина, (2) химотрипсина, (3) овальбумина, (4) лизоцима и (5) БСА.
Вставка:зависимости максимальных (■) и интегральных () интенсивностей линий спектров белков, нормированных намаксимальную и интегральную интенсивности линии конканавалина, соответственно, в диапазоне 200 – 280 см1от содержания в белках β-структур.На Рис. 3 представлены ИК-Фурье спектры исследуемых белков во втором диапазоне(200 – 280 см-1).
Прослеживается тенденция к уменьшению интенсивности линии попоследовательности «конканавалин – химотрипсин – овальбумин – лизоцим – БСА» отсильно интенсивной до почти неразличимой. При этом положение этой линии такжеменяется. Опираясь на эту закономерность, сделано предположение о том, что показанная нарисунке линия низкочастотного ИК-Фурье спектра белка может соответствовать колебаниямβ-структурныхкомпонентмолекулы.Значительноеотличиеинтенсивностилинииконканавалина от интенсивностей линий других белков может быть связано с отсутствием внем α-спиральных фрагментов и дисульфидных связей.Третьим обнаруженным конформационно-чувствительным спектральным диапазономявляется диапазон 275 – 375 см-1. Общая тенденция в изменении формы и положениямаксимумов линий для разных белков позволяет характеризовать вторичную структуру.
Так,низкочастотная спектральная компонента (318 см-1) указывает на принадлежность белка кα-спиральным.14В спектрах неглобулярных (суперспиральных) белков (фибриногена и коллагена)присутствуют интенсивные линии, которые отсутствуют в спектрах всех остальных(глобулярных) белков.Эксперименты с применением КР спектроскопии также позволили выделитьнесколько конформационно чувствительных диапазонов низкочастотных спектров белков.Рис. 4. КР спектры (1) овальбумина, (2) химотрипсина, (3) конканавалина, (4) фибриногена, (5) лизоцима, (6)коллагена и (7) БСА.На Рис. 4 представлены полученные в результате обработки спектры всехисследуемых белков в диапазоне 40 – 200 см-1.Во всех спектрах присутствует широкая линия с центральным пиком около 100 – 120см-1.
Два β-структурных белка (химотрипсин и конканавалин), а также овальбумин имеютпочти одинаковую форму линии спектра с центральным максимумом на частоте около 105см-1 (рис.4а). Небольшие отличия можно заметить лишь в интенсивности линии:конканавалин, практически не содержащий α-спиральных фрагментов и имеющий в своемсоставе чуть большее количество β-структурных элементов, имеет незначительно болееинтенсивную линию в спектре. При этом в спектре химотрипсина присутствует чуть болееинтенсивное плечо на частоте около 150 – 160 см-1. Четыре α-спиральных белка (БСА,лизоцим, фибриноген и коллаген) образуют вторую группу белков, формы линий спектракоторых очень похожи.
Плечо на частоте 150 – 160 см-1 интенсивнее проявляется в спектрах15α-спиральных белков. Отметим также, что отличие формы линии коллагена может бытьсвязано с особенностью (левоспиральностью) коллагена.Более высокочастотный диапазон (180 – 470 см-1) также может быть названконформационно-чувствительным. Спектры белков существенно отличаются друг от друга.Так, например, происходит смещение центральной частоты линии в диапазоне 200 – 270 см-1в низкочастотную область при уменьшении содержания α-спиралей. Однако, овальбумин,лизоцим и коллаген выпадают из этой тенденции. В спектре каждого белка наблюдаетсялиния в диапазоне 280 – 350 см-1 , но положения этих линий различны.
Наблюдаютсяизменения формы, амплитуды и положения линий в спектральном диапазоне 390 – 440 см-1.Объяснить наблюдаемые существенные спектральные различия разницей в содержанииэлементоввторичнойструктурыилиразницеймолекулярныхмассбелковнепредоставляется возможным.Известно, что низкочастотные линии спектров могут быть приписаны скелетнымколебаниям молекул или колебаниям идентичных фрагментов различных аминокислот.Следовательно, низкочастотные спектры не должны быть чувствительны к вариациям ваминокислотном составе белков и можно было бы ожидать сходства спектров.
Тем не менее,наблюдаются значительно отличающиеся друг от друга низкочастотные КР спектры белков вдиапазоне 180 – 470 см-1. Спектральные линии едва ли могут быть соотнесены ссогласованнымиколебаниямбольшихфрагментовмолекулилисубглобулярнымиколебаниями в связи с отсутствием зависимостей между спектральными изменениями имолекулярной массой белков. В то же время, наблюдаемые различия КР спектров не могутбыть интерпретированы с использованием различий в содержании элементов вторичнойструктуры.
В связи с этим можно предположить, что отличия спектров белков могут бытьсвязаны с различиями в третичной и (или) четвертичной структурах молекул.В пятой главе представлены результаты изучения изменений колебательныхспектров, связанных с денатурацией и ингибированием белков.Одним из способов, позволяющих определить конформационно-чувствительныелинии в спектре белка, а значит, получить информацию об изменениях, происходящих в егоструктурной организации, является сравнение спектров нативного белка со спектрами белкав модифицированном состоянии.Некоторые химические реагенты специфически взаимодействуют со структурнымиэлементами белковой глобулы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
