Автореферат (1103977), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Существующие теории и оценки указываютнавозможностьиспользованиянизкочастотнойколебательнойспектроскопиидляисследования колебаний молекулярных комплексов; отдельных частей конструкции «белокмашина», с движением которых связано функционирование молекул; а также крупныхфрагментов – элементов хиральной иерархии белковых молекул.Цель исследованияЦелью диссертационной работы является анализ спектральных изменений внизкочастотных колебательных спектрах, соответствующих функционально-значимымструктурным изменениям молекул белков.Задачи исследованияВ ходе выполнения диссертационной работы были поставлены и решены следующиезадачи:1.
Приготовление образцов для ИК-Фурье спектроскопии и спектроскопии ТГцпоглощения белков, а также выбор методов математической обработки дляанализа низкочастотных колебательных спектров.2. Поиск в низкочастотном диапазоне спектральных проявлений взаимодействияхимотрипсина с краун-эфиром, приводящего к увеличению функциональнойактивности белка в органических растворителях.3. Выявление конформационно-чувствительных линий в низкочастотных ИК-Фурье,ТГц и КР спектрах белков.6Методы исследованияЭксперименты по КР спектроскопии проводились на КР-микроскопе DXR RamanMicroscope (Thermo Scientific), низкочастотные ИК-Фурье спектры измерялись наспектрометре Nicolet 6700 (Thermo Scientific). Данные по ТГц-спектроскопии получены врезультате экспериментов на двух оригинальных установках.Для обработки полученных результатов применялись различные компьютерныепрограммы, позволяющие проводить вычитание фона и сравнение спектров между собой.ДляанализанизкочастотныхКРспектровисходныеэкспериментальныеданныеподвергались математической обработке с использованием преобразования, позволяющегоизбавиться от вклада рэлеевского рассеяния.Научная новизнаПроведен совместный анализ низкочастотных ИК-Фурье и КР спектров белков сразличной вторичной структурой.Проведено сравнительное исследование влияния различных денатурирующих агентовна низкочастотные колебательные спектры белков.Измереныспектрытрис(гидроксиметил)аминометана,ТГц18-краун-6поглощенияиихкомплексовхимотрипсина,сразличнымиконцентрациями, проведено сравнение полученных результатов с данными ИК-Фурье и КРспектроскопии.Теоретическая и практическая значимостьРазработана методика приготовления образцов для экспериментов по низкочастотнойИК-Фурье и КР спектроскопии белков.
Предложена техника обработки и анализанизкочастотных колебательных спектров.Полученные результаты расширяют современные (весьма ограниченные) базы данныхпо низкочастотным колебательным спектрам белковых молекул.Результаты работы могут быть применены для контроля состояния лиофилизованныхбелковых препаратов белков в различных биотехнологических, терапевтических идиагностических применениях.Результаты работы позволяют применять методы низкочастотной ИК-Фурье и КРспектроскопии для анализа функционально-значимых структурных изменений и вторичнойструктуры молекул белков.7Положения, выносимые на защиту1. Низкочастотные (100 –500 см-1)колебательные модыбелковых молекулчувствительны к структурным изменениям, связанным со взаимодействиямиповерхностных групп, ингибированием фермента, разрывом дисульфидных мостикови термической денатурацией.2.
Значительные различия низкочастотных (100 – 500 см-1) колебательных спектровбелков с существенно отличающейся вторичной структурой доказывают, чтоколебательная спектроскопия в этом интервале является эффективным методом дляописания конформационнных изменений белковых молекул.3. Спектроскопия ТГц поглощения и низкочастотная ИК-Фурье спектроскопиявыявляютобразованиекомплексовхимотрипсин-краун-эфир,объясняющееувеличение активности фермента в органических растворителях.Личный вклад автораАвтор самостоятельно получил представленные в диссертации экспериментальныерезультаты,разработалметодикиприготовленияобразцов,провелобработкуиинтерпретацию экспериментальных данных, а также сформулировал выводы по результатамработы.Апробация работыРезультаты работы были представлены на 17 научных конференциях (в том числе на14 международных конференциях).ПубликацииПо теме диссертации опубликовано 9 статей в рецензируемых международных ироссийских журналах, из них 6 индексируются в Web of Science, 6 в Scopus и 1 в RSCI.Также опубликованы тезисы докладов в сборниках конференций.Структура и объем диссертацииДиссертация состоит из введения; 5 глав, содержащих обзор литературных данных,изложение и обсуждение результатов; заключения и списка литературы.
Работа изложена на97 страницах, включает 4 таблицы и 35 иллюстраций. Список литературы включает 150наименований.8Основное содержание работыВо введении кратко излагается мотивация выбора темы диссертации и постановкацелей и задач работы.В первой главе представлен обзор литературы. Описано современное состояниеисследований в области колебательной спектроскопии белков. Представлены результаты поизучению эффекта изменения функционирования водорастворимого белка химотрипсина вневодном окружении, а также по влиянию изменения структуры белка вследствиеденатурации и ингибирования на его функционирование.Показано, что применение белков в органических растворителях позволяет изменитьнекоторые их свойства.
Становится возможным подавление реакций, протекающих в воднойсреде,изапускпроцессовсинтезановыхсоединений.Однако,использованиеводорастворимых белков в неводных средах (органических растворителях) зачастуюприводит к уменьшению их функциональной активности. Обсуждаются работы, в которыхдля увеличения активности химотрипсина в органическом растворителе предлагаетсяиспользовать краун-эфир. Этот эффект предположительно связан с взаимодействиемповерхностных аминогрупп белка с молекулами краун-эфира.В главе также обсуждается актуальность исследования образцов в лиофилизованномсостоянии.Представлены работы по применению методов колебательной спектроскопии взадачах определения структуры биологических молекул.
Наиболее тщательно на текущиймомент исследован диапазон «отпечатков пальцев». Основные приписки линий ИК и КРспектров сведены в таблицу. Обсуждаются перспективы применения низкочастотногоспектрального диапазона в изучении структуры белковых молекул.Во второй главе описаны использованные в работе экспериментальные установки, атакже методы, которые применялись для обработки экспериментальных данных.Для измерения ИК-Фурье спектров использовался коммерческий спектрометр Nicolet6700, позволяющий регистрировать спектры в широком диапазоне (50 см-1 – 4000 см-1) сразрешением 2 см-1.Измерения в ТГц диапазоне проводились на двух установках с различнымипараметрами. Первая из них – терагерцовый спектрометр ZAP-ABCD фирмы ZomegaTerahertz Corporation со спектральным диапазоном 0,1 – 30 ТГц (3–1000 см-1).
Втораяустановка является оригинальной, ее спектральный диапазон 0,15–4 ТГц (5–130 см-1).Эксперименты с применением метода спектроскопии комбинационного рассеянияпроводились на КР-микроскопе DXR Raman Microscope (Thermo Scientific). Спектральныйдиапазон этого прибора от 50 до 3550 см-1. Спектральное разрешение зависит от9используемого объектива и апертуры и изменяется в диапазоне от 1 до 8 см-1,пространственное разрешение составляет 1 мкм.Для анализа полученных результатов применялось несколько методов обработкиэкспериментальных данных, позволяющих проводить вычитание фона и осуществлятьсравнение данных [9,10,11,12].В третьей главе рассматривается вопрос о функционировании водорастворимогоферментахимотрипсинавневодномокруженииипроводятсясоответствующиеэксперименты с применением методов низкочастотной ИК-Фурье и ТГц спектроскопии.Известно, что функционирование белка определяется его структурой.
Замена водногоокружения химотрипсина органическим растворителем приводит к уменьшению егофункциональнойактивности,новприсутствиимолекулкраун-эфираскоростькатализируемых химотрипсином реакций может увеличиться почти на три порядка. Дляисследования механизма этого процесса, который, возможно, объясняется взаимодействиемкраун-эфирасповерхностнымиаминогруппамибелка,былипримененыметодыколебательной спектроскопии. Так как линии аминогрупп в колебательном спектре сильноперекрываются с линией амид I белка, прямое исследование взаимодействия поверхностныхаминогрупп химотрипсина с краун-эфиром затруднено.
В связи с этим для проверкисуществующихпредставленийбылоиспользованосоединениетрис(гидроксиметил)аминометан (HOCH2)3CNH2 (трис), чья аминогруппа может бытьиспользована как модель аминогруппы белка. В экспериментах были использованыпротонированная и непротонированная формы триса, а также краун-эфир 18-краун-6 (краун).Результаты ТГц и ИК-Фурье спектроскопии смеси непротонированного триса скрауном показывают аддитивность спектров: спектры смеси могут быть представлены в видесуперпозицииспектровчистыхкомпонент,чтоуказываетнаотсутствиекомплексообразования. Небольшие спектральные различия в диапазоне «отпечатковпальцев» ИК-Фурье спектров позволяют предположить, что в результате лиофилизациипроисходит формирование микрокристаллов триса и крауна, которые взаимодействуютмежду собой на границах.Протонированный трис ведет себя иначе при взаимодействии с крауном. На Рис.
1представлены ТГц спектры протонированного триса, крауна и смесей трис-краун смолярными отношениями триса и крауна 1:1 и 1:10, соответственно. В спектрепротонированного триса присутствуют линии на частотах 2.0, 2.7, 3.2, 3.8 ТГц. Расчетыпоказывают, что соответствующие моды отвечают торсионным и деформационнымколебаниям молекулы триса с участием межмолекулярных колебаний, а колебание на10частоте 1.43 ТГц соответствует моде, в которой молекула триса осциллирует как целое вдольэлементарной ячейки.Рис. 1. ТГц спектры комплексов протонированный трис-краун в соотношении 1:1 (1), протонированного триса(2), крауна (3) и комплексов протонированный трис-краун 1:10 (4).Спектр смеси 1:1 значительно отличается от спектров чистых компонент.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
