Диссертация (1103954), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Коллегами Е.Г. Холиной, А.М. Нестеренко и М.В. Серебряковой были получены и проанализированы данные масс-спектрометрии соответствующих образцов (рис. 4.24). Используя молекулярный редактор Pymol, на основании литературныхданных о существующей структуре молекул ЛПС Re-мутантов были построены различныеварианты структур с различной длиной ацильных цепей.Рис. 4.24: Данные масс-спектрометрии в режиме регистрации катионов (красный спектр) ианионов (синий спектр) для липополисахарида S. typhimurium R595 (A).
Структуры, соответствующие подписям на пиках, изображены справа (B). Масс спектры были получены спомощью метода матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации в линейном режиме с точностью около1 Дана приборе ЦКП МГУ (MALDI TOF/TOF, Brucker Daltonics),расположенного в НИИФХБ МГУ.Как следствие частичной деградации молекулы во время ионизации, в спектре присутствует множество “осколков” целой молекулы, содержащие разное количество остатков Kdoи Ara4N, и пять остатков жирных кислот. Однако, в спектре присутствуют и фрагментыс двумя остатками Ara4N, что указывает на то, что молекулы с двумя остатками Ara4N164присутствовали в исходном пуле в достаточном количестве. С другой стороны, в спектрене обнаружено пиков, соответствующих молекулам, вовсе не несущим Ara4N.
Таким образом, мы ожидаем, что в реальной мембране могут встретиться липиды с одним или двумяостатками Ara4N на молекулу ЛПС.Присоединение остатков Ara4N происходит по остаткам фосфорной кислоты, замещающим свободные 1’- и 4’-гидроксилы остатков глюкозы липида А (рис. 4.24). Таким образом,эти остатки располагаются в непосредственной близости от гидрофобной области бислоя ив одной плоскости с остатками глюкозы липида А.
Благодаря такому расположению, Ara4Nпотенциально способны увеличивать проекционную площадь липида А и, как следствие,среднюю площадь полноразмерных ЛПС в проекции на плоскость мембраны. Для проверкиэтих предположений мы построили две модели симметричных Re-LPS бислоев, состоящихиз молекул, несущих один и два остатка Ara4N в составе липида А (размер систем составлял16 молекул на монослой), и сравнили их ApL с таковой для безарабинозного Re-LPS бислоя,рассмотренного в разделе 6.1 (рис.
4.25). Для каждой модели Re-LPS бислоя были проведены500 нс релаксационные расчеты МД, в ходе которых площадь рассматриваемых фрагментовдостигла стабильных значений. При этом, для Ara4N-содержащих мембран ApL оказаласьсущественно выше, чем для мембран, состоящих из ЛПС без арабинозы (рис. 4.25 D). Так,площадь Re-LPS мембраны, не содержащей Ara4N, составила 150.6 ± 2.4 Å2, в то время какдобавление одного остатка Ara4N увеличило это показатель до 172.5 ± 1.6 Å2, а второго — до180.4 ± 1.6 Å2 .Отметим, что наблюдаемый эффект не был зарегистрирован при моделировании аналогичных по составу мембран в более ранней работе Kim et al.
[218]. Это, по-видимому,связано с тем, что авторы работы полагали, что липид А штаммов Salmonella по умолчанию несет 7 ацильных цепей, в то время как для рассмотренного нами штамма данныемасс-спектрометрии указывают на присутствие 5 или 6 ацильных цепей в составе липида А (рис. 4.24).
ApL модельных бислоев из работы [218] оказалась нечувствительной кприсутствию остатков арабинозы (176.2 ± 1.2 и 178.0 ± 0.9 Å2 для безарабинозной и несущейдва остатка Ara4N на липид, сооветственно). Таким образом, влияние структуры полярнойголовки, вероятно, наиболее выражено для липидов с меньшим объемом гидрофобной частимолекулы липида А.165Рис.
4.25: Структура поверхности мембраны Re-LPS/Re-LPS, рассмотренной в разделе 6.1 (A), а также Re-LPS/Re-LPS бислоев, содержащих в составе липида А один (B) идва (C) остатка Ara4N, и также значения ApL для трех структур (D). Остатки Ara4N выделены голубым цветом.Из результатов моделирования следует, что цепи О-антигена в Ara4N-содержащих мембранах должны быть распределены более разреженно, а их упаковка должна быть менееплотной.
Открытым остается вопрос о том, при какой степени равномерного разреженияв расположении О-антигенов на поверхности мембраны происходит качественный переходмежду двумя типами упаковки цепочек: плотным слоем единообразно сложенных наклоненных и вытянутых О-антигенов, наблюдаемый в модели чистой ЛПС-мембраны (рис. 4.20 A), игетерогенного слоя переплетенных цепей, полученного в модели белок-содержащей мембраны (рис. 4.20 B). Исследованию этого вопроса будут посвящены наши будущие модельныеработы по моделированию гладких ЛПС-мембран с разным содержанием остатков Ara4N.ЗаключениеВ ходе выполнения диссертационной работы были получены следующие основныетатыи сделаны следующиерезуль-выводы:1.
В реакционно-диффузионной модели основных реакций каскада свертывания были получены аналитические условия существования автоволновых решений, а также решений стационарной системы типа пульс, определяющих достаточное условие начала распространения автоволны концентрации тромбина в ответ на возмущение системы. Таким образом, критическая для начала роста тромба концентрация тромбина, образованная в ответ на активацию внешнего или внутреннего пути, может быть оценена какрешение типа пульс для модели основных реакций каскада свертывания.2. Получены аналитические оценки скорости распространения автоволновых решенийреакционно-диффузионной модели основных реакций каскада свертывания.
Таким образом, скорость роста тромба в рассматриваемой модели может быть приближенновычислена через значения параметров системы до проведения модельных расчетов.3. В численном эксперименте для упрощенной модели образования тромба в венуле диаметром 50 мкм оценен критический размер зоны повреждения на стенке сосуда (∼ 50–90 мкм), ведущий к закупорке сосуда при запуске внешнего пути каскада свертываниякрови. Повреждения такого размера при сепсисе может соответствовать откреплениюодного эндотелиоцита в результате взаимодействия с ЛПС.4. Разработана кинетическая модель активации контактного пути ЛПС-агрегатами, воспроизводящая доступные экспериментальные данные in vitro.
Показано, что немонотонная зависимость степени активации контактной системы от концентрации ЛПС (максимальная активность при концентрации ЛПС ∼ 20 мкМ) обусловлена агрегатным со-стоянием ЛПС в растворе. Таким образом, надмолекулярная структура ЛПС должнаоказывать существенное влияние на активацию внутреннего пути каскада свертываниякрови.1661675.
Созданы полноатомные модели молекул Re-, Ra и S-LPS на базе силового поля OPLSAA с использованием разработанной в нашей группе программыTppMkTop. Недоста-ющие силовые параметры были рассчитаны с использованием методов. Сило-ab initioвые параметры ацильных цепей валидированы в уравновешивающих расчетах бислоевиз простых липидов с известной равновесий площадью на липид.6.
Проведена серия МД расчетов для длинной цепи О-антигена (12 RU) в растворе. В ходерасчетов показано, что переходы клубок-глобула для длинной цепи обратимы в полеOPLS-AA (время жизни 10–40 нс) и необратимы в поле GLYCAM, что делает OPLS-AAпредпочтительным силовым полем для моделирования S-LPS.7. В МД расчетах показано, что основным событием, ведущим к компактизации Оантигенареход вS. typhimuriumантикак в растворе, так и в мембранном кружении, является пе--� состояние О-гликозидной связи между остатками маннозы и рамнозы.Для компактизации цепи в растворе достаточно перехода ∼ 3 % связей).
Повышеннаязаселенность этой конформации, по-видимому, носит энтропийную природу и обусловлена структурой восстановленного остатка рамнозы.8. Созданы МД модели мицелл, состоящих из 4, 6, 8 и 14 молекул Re-, Ra- и O3-LPS, ипоказано, что увеличение длины углеводной части ЛПС в их составе ведет к стабилизации структуры за счет взаимодействия О-антигенных цепочек друг с другом.
Показано,что увеличение количества молекул в составе мицеллы ведет к снижению площади гидрофобной поверхности, экспонированной в раствор. Структура полученных агрегатовпозволяет сделать предположение, что рассматриваемые ЛПС S.typhimuriumсклонныформировать ламеллярные структуры в растворе.9. Построено две МД модели S-LPS мембран и показано, что структура О-антигенногослоя на их поверхности существенно зависит не только от среднего значения доступного объема, приходящегося на одну цепь, но и от равномерности распределения Оантигенных цепей в начальный момент времени. Длинные цепи О-антигена в чистойЛПС мембране образуют плотный слой, взаимодействуя друг с другом преимущественно в вытянутом состоянии.
В то же время, в белок-содержащей мембране происходитпереплетение цепей О-антигена и формируется сложная гетерогенная структура с заполненными водой полостями с характерным размером ∼ 1 нм3 , причем запутываниеО-антигенов на поверхности мембраны происходит за счет взаимодействия их центральных частей.16810.
Сконструированы три МД модели симметричных Re-LPS бислоев, состоящих из молекул, несущих два, один и ни одного остатка Ara4N в составе липида А. Показано, чтодобавление Ara4N в состав ЛПС с небольшим размером гидрофобной части, ведет кувеличению равновесной площади, приходящейся на один липид (до1.2раза). Такимобразом, модификации липида А влияют на плотность упаковки О-антигенных цепейна поверхности мембраны.Полученные теоретические результаты для математической модели каскада свертываниякрови могут быть далее использованы для оценки величины критического возмущения системы при численном моделировании более сложных систем, в частности, при активациисистемы свертывания липополисахаридами.
Построенная нами модель образования тромбав ответ на повреждение стенки сосуда может также быть использована для разработки болеедетальных моделей тромбообразования, учитывающих роль активированных тромбоцитов впроцессе формирования сгустка. Модели такого типа могут быть также использованы длямоделирования образования сгустка в ответ на попадание в кровь ЛПС или иных веществ,повреждающих эндотелиальный слой сосуда, при условии, что модель будет учитывать различные типы и величины повреждений. Модель активации контактного пути может быть, всвою очередь, в дальнейшем использована для оценки влияния различных концентраций иразличного агрегатного состояния ЛПС на скорость свертывания плазмы.Рассчитанные дополнительные параметры межатомных взаимодействий и разработаннаяпрограмма по созданию молекулярных топологий TppMkTop могут быть использованы длясоздания широкого спектра моделей молекул ЛПС различной химической структуры.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
