Диссертация (1103954), страница 31
Текст из файла (страница 31)
RMSD, рассчитанный для Cα-атомов всехмолекул OmpA по последним 50 нс траектории по отношению к кристаллической структуре,составляет 4.0 ± 0.9 Å. Такое большое значение RMSD неудивительно, поскольку условиякристаллизации белка значительно отличаются от моделируемого окружения. Кроме того,очень высока подвижность неструктурированных петель, где суммарное смещение (RMSD)атомов может достигать 1 нм, тогда как смещение атомов � -бочонка составляет около 1.5 Å.
Вто же время, RMSD, рассчитанный по отношению к новому, адаптированному к мембранномуокружению состояния, равен 0.77 ± 0.09 Å, что означает, что структура белка стабильна вновом состоянии. Для оценки подвижности белка мы рассматривали динамику каждой извосьми молекул OmpA в модельном бислое. Центральная полость � -бочонков белков OmpA всреднем содержит около 100 молекул воды, которые преимущественно распределены вблизинаружной поверхности мембраны (рис. 4.20 В).158Отметим, что наличие молекул белка в модельной мембране существенно влияет на подвижность липидов. В то время как симметричный ЛПС-бислой E.
coli , “расплавился” в ходерасчетов в предыдущей модельной работе [25], мы не наблюдали этого эффекта в наших расчетах. Коэффициент латеральной диффузии (�) для Ra-LPS в наших расчетах составлялоколо 10−9 см2/с, и � < 2 · 10−10 см2/с для O12-LPS и не может быть точно вычислен для1 мкс траектории. Полученные оценки коэффициентов диффузии заметно ниже экспериментально измеренных коэффициентов диффузии простых фосфолипидов [291], что связаннокак с относительно большой массой ЛПС, так и с латеральным взаимодействием длинныхцепочек О-антигена. Кроме того, на коэффициент диффузии липидов оказывает влияниеприсутствие относительно большого количества белка в нашей модели.
Молекулы OmpA, всвою очередь, демонстрируют еще более низкую подвижность (� < 3 · 10−11 см2/с), котораяв целом согласуется с обычными значениями для коэффициента диффузии интегральныхбелков [291]. Ранее было показано, что низкая подвижность ЛПС также связана с сильнымвзаимодействием отрицательно заряженных фосфатных и карбоксильных групп в основнойчасти ЛПС с двухвалентными катионами, в первую очередь, с Ca2+ [25,26]. В настоящем исследовании мы не включали ионы кальция в модельные системы для того, чтобы повыситьмобильность молекул ЛПС для эффективного сканирования конформационного пространства.Влияние белковых глобул на структуру липидного бислоя было ранее исследовано в ходе моделирования наружной мембраны E.
coli [26]. В то время как толщина гидрофобногобислоя для симметричной ЛПС-мембраны довольно однородна (21–22 Å [25]), то толщинагидрофобного слоя в мембране, содержащей белок, снижается в непосредственной близости от белковой глобулы [26]. Толщина чистого асимметричного бислоя (PE:PG)/Ra-LPS, наудалении от интегральных белков, составляет около 25 Å, тогда как толщина гидрофобногобислоя вблизи белка составляет около 20 Å [26].
Мы не наблюдали такого эффекта в нашихрасчетах, что можно объяснить другим соотношением белок/ЛПС в нашей модели. Вместоодного � -бочонка крупного белка OmpLA в довольно большом фрагменте очень стабильного липидного бислоя (PE:PG)/Ra-LPS (∼ 9 × 9 нм) [26], мы использовали восемь копийнемного меньших по размеру белков, встроенных в фрагмент мембраны с общими размерами 8.8 × 9.4 нм, что отражает соотношение площади ЛПС/белок в реальных бактериальныхмембранах [168].1596.3.1Конформация О-антигенов в мембранном окруженииЗа время расчетов структура цепей О-антигенов существенно изменяется.
Прежде всего, общая длина цепи уменьшается из-за процесса запутывания и разрушения начальной спиральной структуры, которая оказывается энтропийно неустойчивой в мембранном окружениитак же, как это было в растворе с одиночной цепочкой (раздел 1.2.2). Из анализа конформаций цепочек О-антигенов в представлении (�, �) (рис. 4.21) хорошо видно, что основнымпроцессом, способствующим изломам цепи в обеих моделях, как и в случае одиночной молекулы (рис. 4.11), является переход в анти -� состояние связей � ���ℎ�.
Карты заселенности (�, �) состояний в случае чистой S-LPS-мембраны (рис. 4.21 A–C) схожи с картамидля свободной цепи О-антигена в растворе, однако мы дополнительно наблюдаем несколькопереходов в анти -� состояние связей �ℎ���� (рис. 4.21 C), не покидающей бассейна глобального минимума в случае одиночной цепи, и имеющей достаточно низкую энергию ввакуумных расчетах для дисахаридов (рис.
4.3 C). Отличия поведения О-антигенов в мембране, содержащей белок, от поведения свободного О-антигена еще более существенны. Большинство связей ���� �� в мембранном окружении занимают положение, соответствующеелокальному минимуму �� (рис. 4.21 D), вместо глобально энергетически выгодной конформации �� (рис. 4.2 A). Достаточно высокая степень заселенности анти -� состояния связи� ���ℎ� (рис. 4.21 E) свидетельствует о наличии множественных изломов цепи. Пиранозные кольца в чистой ЛПС-мембране, в свою очередь, демонстрируют уровень подвижности,схожий с подвижностью колец в расчетах свободного О-антигена в растворе (рис.
4.22 A–C, 4.11 D–F). В то же время, переход ���� �� связи в альтернативное энергетически выгодное состояние ведет к тому, что кольцо маннозы в расчетах для мембраны, содержащейбелок, преимущественно находится в конформации твист (рис. 4.22 E), что отличается отповедения цепи в растворе.160Рис. 4.21: Карты заселенности конформаций О-гликозидных связей О-антигена в МД расчетах для модели чистой ЛПС-мембраны (верхний ряд), и модели мембраны, содержащейбелок (нижний ряд).Рис. 4.22: Карты заселенности конформаций О-гликозидных связей О-антигена в МД расчетах для модели чистой ЛПС-мембраны (верхний ряд), и модели мембраны, содержащийбелок (нижний ряд).Различия в конформационной подвижности О-антигенных цепей в двух моделях мем-161браны обусловлены различиями в их окружении.
Равномерно распределенные цепи в чистой ЛПС-мембране взаимодействуют попарно и слипаются друг с другом, сохраняя относительно вытянутую конформацию. Результирующий слой О-антигенов на поверхностимембраны имеет относительно однородную структуру (рис. 4.20 A) и высокую плотность.Наличие молекул белков в ЛПС-бислое, в свою очередь, ведет к образованию неравномернораспределенных полостей между О-антиген-несущими молекулами ЛПС. Таким образом, вбелок-содержащей модели О-антигены демонстрируют существенно более сложное поведение, чем в чистой мембране. О-антигены активно взаимодействуют друг с другом, образуютмножественные шпильки за счет переходов в О-гликозидных связях и изменениях в конформациях колец, запутываясь друг с другом. В результате таких сложных взаимодействий,О-антигены укладываются на поверхности мембраны, образуя крайне гетерогенную структуру.
В частности, над молекулами белков образуются водные полости размером порядка1 нм3 , разделенные областями пространства, занятыми плотно переплетенными цепочкамиО-антигена.Разница в поведении О-антигенных цепей в зависимости от окружения также хорошовидна при оценке подвижности различных фрагментов цепи (рис. 4.23). В обеих моделях мынаблюдаем относительно высокую подвижность углеводных остатков со средними отклонениями 2–3 нм за одну наносекунду.
В предыдущих модельных исследованиях чистых ЛПСбислоев [25] авторы наблюдали увеличение подвижности для наиболее удаленных от мембраны повторяющихся звеньев (4–5 нм вместо 2–3 нм для остальной цепи [25]). Однако, мы ненаблюдаем такого эффекта для нашей модели чистой ЛПС мембраны (рис. 4.23 А). Увеличение подвижности терминальных звеньев цепи О-антигена также наблюдалось при расчетахдинамики мембраны, содержащей белок, для более коротких О-антигенов (5 RU) [27]. В нашей модели мы наблюдаем другой интересный эффект: наименьшую подвижность во всейцепи демонстрирует ее медиальная часть, что указывает на запутывание цепей за счет взаимодействия в районе 4–7-го повторяющихся звеньев.
Такое переплетение можно наблюдатьтолько для достаточно длинных О-антигенных цепей и только тогда, когда белки включены в ЛПС-бислой и, таким образом, не были обнаружены ни при моделировании чистых ЛПС-бислоев [26], ни при расчетах для белок-содержащих мембран с малой длинойО-антигенов [27].162Рис. 4.23: Среднеквадратическое отклонение, рассчитанное для разных фрагментов Оантигенной цепи (RMSF), в чистой (А) и белок-содержащей (В) моделях мембраны. RMSFрассчитаны для фрагментов траекторий длиной в1 нс.Красным цветом отмечена областьнизкой подвижности.Многочисленные локальные конформационные изменения, ведущие к полному разупорядочиванию структуры цепей О-антигенов, означают, что начальная спиральная конформация является энтропийно невыгодной.
Действительно, эксперименты ЯМР показывают,что в растворе короткие пентасахариды спонтанно образуют спиральные структуры [29], вто время как такие структуры никогда не наблюдались в модельных мембранах [25] и необнаружены для длинных цепочек.6.4Влияние арабинозы на структуру мембраныВ предыдущем разделе мы рассмотрели различные сценарии укладки полисахаридных цепочек ЛПС в мембранном окружении в зависимости от распределения О-антигенных цепочекна поверхности мембраны. При равных значениях среднего значения доступного объема наодну цепь О-антигена, равномерно распределенные цепи в модели чистого ЛПС-бислоя инеоднородно распределенные цепи в белок-содержащей модели демонстрируют качественноразное конформационное поведение. В то же время, величина доступного объема для отдельных цепей О-антигена может меняться при изменении химического строения молекул ЛПС.В данном разделе будет рассмотрено влияние модификаций структуры липидной части ЛПСна структуру бислоя.Известно [167], что в состав липида A бактерий родовSalmonellaиEscherichiaможетвходить 4-амино-L-арабиноза (Ara4N), либо фосфоэтаноламин, присоединенные к одному избоковых фосфатов.
Наличие таких модификаций клинически значимо, так как положитель-163но заряженный остаток Ara4N, частично нейтрализует отрицательный заряд липида А ицентрального олигосахарида, тем самым снижая восприимчивость бактерии к катионнымантимикробным пептидам и полимиксину [292]. В частности, мутанты S. typhimurium, мембраны которых содержит ЛПС, несущие Ara4N в достаточном количестве, устойчивы к воздействию полимиксина [293]. В нашей лаборатории проводилась экспериментальная работа скоммерчески доступным Re-LPS бактерии S. typhimurium штамма R595, которая позволилаопределить, насколько распространены липиды, содержащих Ara4N в суммарной фракциибактериального липида А.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
