Диссертация (1103954), страница 30
Текст из файла (страница 30)
В основе ее работы лежат принципы химиче-ской информатики, позволяющие однозначно описывать химическую структуру при помощистрок символов (SMARTS), что подробно описано в разделе 1.1 главы 2. Для каждого новоготипа атома, отсутствующего в силовом поле OPLS-AA, база данных химических фрагментов была дополнена шаблоном SMARTS, описывающим его химическое окружение. Такимобразом, в текущей версииS. typhimuriumTppMkTopпозволяет создавать молекулярные модели ЛПСс различной длиной О-антигена. Эти модели были далее использованы намидля создания моделей надмолекулярных ЛПС-структур.5Модели агрегатов ЛПСЯвляясь амфифильными молекулами, ЛПС в растворе склонны образовывать надмолекулярные агрегаты. Структура агрегатов в большой степени определяет степень их биологической активности. В частности, как показано в разделе 2.2 главы 1, структура агрегатов ЛПСможет быть определяющим фактором при активации контактной системы свертывания крови. В данном разделе мы рассматриваем молекулярные модели агрегатов, полученные для151модели ЛПС-молекулы в разделах 1–4.Как было показано в экспериментальных исследованиях по воздействию антимикробныхпептидов на агрегаты различной структуры, устойчивость ЛПС к воздействию препаратасильно зависит от наличия в их составе углеводной цепи О-антигена [20].
Более того, архитектура агрегатов во многом определяет их устойчивость к воздействию детергентов [20].Поэтому в нашей работе мы рассмотрели модели мицелл, состоящих из ЛПС с разной величиной гидрофильной части и оценили вероятность формирования и потенциальную устойчивость мицеллярных структур в растворе для ЛПС разного состава. Подробное описаниесоздание молекулярных моделей приведено в разделе 1.3.4 главы 2.Мы рассмотрели модели мицелл, состоящих из � молекул Re-, Ra- и S-LPS, где � =4, 6, 8, 14 молекул на мицеллу. Результирующие структуры после уравновешивающего МДрасчета представлены на рис. 4.16. Основным параметром, использованным нами для оценкиустойчивости полученных структур, является площадь гидрофобной поверхности липида А,экспонированная в раствор.
Эта величина, с одной стороны, отражает вероятность существования подобных структур в водном растворе, а с другой — потенциально определяетстепень активности рассматриваемых агрегатов, так как именно липидная часть ответственна за активацию как иммунного ответа, так и контактной системы свертывания крови (см.раздел 2.2 главы 1). Для каждой структуры была рассчитана площадь экспонированной враствор гидрофобной поверхности, приходящейся на одну молекулу агрегата:�1 =�hydrophobic,�где �hydsrophobic была рассчитана для последних 50 нс траектории с использованием процедуры, описанной в разделе 1.3.4 главы 2 (рис. 4.17).152Рис.
4.16: Финальная структура моделей ЛПС-мицелл, состоящих из четырех (A–C), шести (D–F), восьми (G–I) и четырнадцати (J–L) молекул. Рассмотрены структуры агрегатов,формируемые Re- (A,D,G,J), Ra- (B,E,H,K) и O3-LPS (C,F,I,L). Оранжевым цветом отмеченагидрофобная часть молекул, красным — полярные головки липидов, бирюзовым — внутреннее ядро, зеленым — внешнее ядро, фиолетовым — цепи О-антигена.153Рис. 4.17: Площадь экспонированной в раствор гидрофобной части ЛПС, приходящейся наодну молекулу агрегата (�1) как функция количества молекул в структуре агрегата (� ).Оранживая линия — Re-LPS, зеленая линия — Ra-LPS, фиолетовая линия — О3-LPS.Хорошо видно, что площадь �1 убывает с увеличением числа молекул, входящих в составмицеллы.
Более того, площадь контактирующей с раствором гидрофобной части ожидаемо снижается с увеличением углеводной составляющей молекул ЛПС. Тем не менее, длявсех полученных агрегатов ее величина достаточно велика, что, видимо, свидетельствует отом, что рассматриваемые молекулы склонны формировать агрегаты, содержащие большееколичество молекул, чем может быть исследовано в рамках МД моделирования.Наблюдения за поведением модельных систем также позволяет нам сделать предположение, что рассмотренные ЛПС склонны формировать ламеллярные фазы, причем устойчивость их структуры должна зависеть от состава молекул. В самом деле, добавление центрального олигосахарида в состав ЛПС ведет к возникновению дополнительных межмолекулярных взаимодействий, вытягивающих структуру отдельных молекул и повышающих степеньупорядоченности ацильных цепей. В то время как этот эффект заметен уже для систем минимального размера (рис.
4.16 B,E), при увеличении числа молекул в мицелле он становитсяеще более выраженным (рис. 4.16 K).Добавление О-антигенов в состав молекул может, в свою очередь, еще больше стабилизировать структуру агрегата. Для мицелл маленького размера большая площадь липиднойчасти по отношению к общей площади мицеллы ведет к тому, что в МД расчетах частьО-антигенных цепей приходит в контакт с липидом А и фиксируется в этом положении154за счет водородных связей и ван-дер-ваальсовых контактов (рис. 4.16 C,F).
В то же время,для систем большего размера О-антигенные цепи взаимодействуют друг с другом, слипаясьпопарно (рис. 4.16 I,L). Для одного из агрегатов мы также наблюдали слипание четырех Оантигенных цепей и формирование квази-стабильной бислоеподобной структуры (рис. 4.16 I).6Модели фрагмента внешней мембраныСледующим этапом наших исследований было создание молекулярных моделей фрагмента наружной мембраны грамотрицательной бактерии. В силу сложности и гетерогенностиее структуры, атомистический подход МД не позволяет учесть все разнообразие молекул,представленных в реальной мембране. В нашем исследовании мы сосредоточились на реалистичном воспроизведении укладки О-антигенных цепей на поверхности мембраны.6.1Модели R-LPS бислоевПредварительным этапом при создании моделей ЛПС-мембран, включающих полноразмерные молекулы S-LPS, была разработка моделей R-LPS бислоев.
Мы использовали силовоеполе OPLS-AA, дополненное рассчитанными ab initio параметрами (раздел 3), для полярных головок. Для ацильных цепей липида А использовались параметры, валидированные врасчетах фосфолипидных бислоев (раздел 2). Протоколы расчетов приведены в разделе 1.3.3главы 2.В первую очередь, нами была проведена серия уравновешивающих расчетов длясимметричного Re-LPS/Re-LPS бислоя, состоящего из наиболее коротких фрагментовЛПС (рис.
4.1). Результирующая структура бислоя представлена на рис. 4.18 A. Равновеснаяплощадь на липид составила ∼ 150 Å2, что соответствует ранее полученным данным по МДрасчетам ЛПС бислоев [218].Далее, в структуру каждого ЛПС был добавлен центральный олигосахарид (зеленыйцвет на рис. 4.18 B), и полученный Ra-LPS/Ra-LPS бислой был вновь уравновешен при температуре 300 К. Результирующая площадь осталась почти такой же, как и для бислоя изRe-LPS (∼ 152 Å2). Полученная уравновешенная структура была использована нами длясоздания моделей мембран из полноразмерного S-LPS.155Рис.
4.18: Финальная структура модели симметричных бислоев Re- (А) и Ra-LPS (C) после 500 нс уравновешивающих расчетов. Оранжевым цветом покрашена гидрофобная частьбислоя, голубой цвет соответствует внутреннему ядру, зеленый цвет — внешнему ядру (см.рис. 4.1). B, D — вид сбоку и сверху на произвольно выбранные молекулы из уравновешенных бислоев. Оранжевым покрашены ацильные цепи, розовым — полярные головки липидов,голубой — остатки Kdo, серый — остальная часть центрального олигосахарида.Как было впервые отмечено в работе [25], увеличение углеводной части ЛПС ведет квытягиванию структуры молекулы. Мы наблюдаем этот эффект для Ra- и Re-LPS мембран.Остатки Kdo связываются друг с другом и полярными головками липида А, и их положение оказывается ближе к параллели с плоскостью мембраны в Re-LPS бислое (рис.
4.18 B),по сравнению с Ra-LPS бислоем (рис. 4.18 D). Добавление полноразмерного центральногоолигосахарида создает дополнительную силу, которая вытягивает остатки Kdo в направлении от поверхности мембраны (рис. 4.18 D). Отметим, что процесс вытягивания структурыKdo носит энтропийный характер: крупный олигосахарид оказывается подвержен броуновским флуктуациям преимущественно в нормальном направлении по отношению к мембране,поскольку в тангенциальном направлении его движения ограничены соседними цепями.1566.2Модели S-LPS мембранКак было показано ранее [25], плотность упаковки О-антигенных цепей может существенно влиять на их подвижность. В нашей работе мы создали две модели наружной мембраны, в каждой из которых полноразмерные ЛПС занимали половину площади в проекциина плоскость мембраны, что близко к экспериментальным оценкам [168].
Первая модельпредставляла собой чистый ЛПС бислой, один из монослоев которого состоял из Ra-LPS,в то время как половина молекул второго монослоя несла на себе О-антиген (рис. 4.19 A).Вторая модель представляла собой бислой Ra-LPS/S-LPS, пронизанный молекулами белкаOmpA (рис. 4.19 B). В качестве стартовой конформации О-антигенных цепей в каждой модели нами была взята структура, полученная в разделе 1.2.1. Мы рассматривали О-антигеныдлиной 12 звеньев, S-LPS такого типа мы далее называем O12-LPS. Для обеих моделей былипроведены МД расчеты, детали которых подробно описаны в разделе 1.3.5 главы 2.Рис. 4.19: Схематическое изображение двух моделей фрагмента наружной мембраны, рассмотренных в работе.6.3Общая структура мембранФинальные структуры ЛПС-содержащих бислоев, полученные после более 500 нс МД расчетапредставлены на рис.
4.20. Толщина гидрофобной области бислоя, рассчитанная как среднеерасстояние между вторыми атомами ацильных цепей в разных монослоях за последние 50 нстраектории, для обеих моделей очень стабильна и равна 35.3±0.1 Å. Толщина зоны полярныхголовок липида А составляет 4.90 ± 0.05 Å для Ra-LPS и 5.70 ± 0.03 Å для O12-LPS. Толщинаслоя центрального олигосахарида также больше для O12-LPS, чем для Ra-LPS (16.2 ± 0.2 Å157вместо 14.0 ± 0.2 Å) за счет вытягивания молекулярной структуры под влиянием длинныхцепей О-антигена [25]. Толщина слоя О-антигенов в среднем составляет 44.3 ± 0.6 Å длябелок-содержащей мембраны и 40.2 ± 0.5 Å для чистой ЛПС-мембраны.Рис.
4.20: Финальная структура модели бактериальной мембраны Ra-LPS/Ra-LPS & О12LPS (А) и мембраны Ra-LPS/O12-LPS/OmpA после 500 нс уравновешивающих МД расчетов.В чистой мембране О-антигенные цепи образуют плотный равномерный слой над поверхностью мембраны (А), в белок-содержащей модели О-антигенные цепи запутаны, образуязаполненные водой полости над белковыми глобулами (В).Структура молекулы OmpA оказывается достаточно стабильна в мембранном окружении,но отличается от кристаллической структуры.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
