Диссертация (1103954), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Тем не менее, можно ожидать что цепи О-антигена об-ладают сложной конформационной динамикой. В самом деле, подвижность на временныхмасштабах от пико- до микросекунд была обнаружена в ЯМР исследованиях для длинной (10 RU) цепи О-антигенаE. coliO91 [228]. Более того, существующие данные о синтезеО-антигена и его роли в жизнедеятельности бактериальных клеток также противоречат гипотезе перехода О-антигенной цепи в стабильное глобулярное состояние.Синтезированные в цитоплазме, О-антигены переносятся через внутреннюю мембрану наее периплазматическую сторону для дальнейшей полимеризации и присоединения к олигосахаридному ядру ЛПС через наиболее распространенный Wzy-зависимый путь [276]. Такимобразом, предварительный фолдинг О-антигена предшествует переносу ЛПС во внешнююмембрану и определяет дальнейшую конформационную эволюцию цепочки О-антигена наповерхности клетки.
Семь белков, образующих периплазматический мостик, перемещаютЛПС из внутренней в наружную мембрану [277, 278]. Во время переноса ЛПС через периплазму цепи О-антигена не покидают гидрофильную среду и складываются без взаимодействия с другими цепями. Следовательно, если предположить, что состояние глобулы предпочтительно для О-антигенного полисахарида, то все цепочки О-антигенов появлялись бына поверхности клетки в виде таких глобул.Гипотеза о глобулярной конформации цепочек О-антигена в мембранном окруженииплохо соответствует существующим данным о проницаемости внешней мембраны. Согласно экспериментальным данным, слой О-антигенов проницаем для молекул с массой ниже600 Да [23], тогда как очень плотные глобулы О-антигена создавали бы плотный барьер,137предотвращающий диффузию куда меньших органических молекул к бислою наружной мембраны. Кроме того, существенное несоответствие вытекает из количественных оценок размеров глобул.
В наших расчетах площадь проекции глобулы О-антигена составляет около8 нм2 (рис. 4.9, 4.10). В то же время, как будет показано в расчетах в разделе 6, и было получено в более ранних работах, липидная часть молекулы ЛПС с пятью ацильными цепями имеетравновесную площадь около 1.0–1.5 нм2 [218]. Поскольку нелипидные компоненты составляют не более 50% поверхности наружной мембраны бактерий [168], то максимальная площадь,занимаемая одним О-антигеном, не может превышать удвоенную равновесную площадь липидной части ЛПС, то есть примерно 3 нм2. Это значение намного меньше расчетной площади проекции глобулы, образованной О-антигеном из 12 повторяющихся звеньев (∼ 8 нм2).Так как цепочки О-антигена в реальных мембранах могут быть значительно длиннее, этаразница может быть еще больше.
Кроме того, транспорт О-антигена на наружную мембрану, выполняемый белковым комплексом LptD-LptE, был бы существенно затруднен в случаеглобулярной структуры О-антигена. Все компоненты ЛПС проходят во внешний слой наружной мембраны через гидрофильную пору в белке LptD, размер которой составляет примерно25 на 15 Å [279]. В то время как поры LptD могут вместить вытянутую цепочку О-антигенадиаметром 12.5 Å, прохождение через них глобул О-антигена невозможно. Таким образом,вероятность образования О-антигенами устойчивых глобул в растворе или на поверхностимембраны крайне мала.Возможные причины наблюдаемой разницы в поведении О-антигена в моделях OPLS-AAи GLYCAM следуют из анализа распределения свободной энергии для дисахаридных остатков (рис.
4.2). В Man-Rha состояние �ψ выглядит существенно более устойчивым в полеGLYCAM по сравнению с полем OPLS-AA, что приводит к различиям в конформационномповедении связей � ���ℎ� в моделях длинной О-антигенной цепи. Действительно, относительная свободная энергия Man-Rha в состоянии �ψ на ∼ 12 кДж ниже в поле GLYCAM, чемв поле OPLS-AA (табл. 4.1).
Кроме того, в модели в поле GLYCAM активационный барьерперехода Man-Rha �ψ → �� на ∼ 8 кДж/моль выше, чем в поле OPLS-AA. В результате,однажды перейдя в низкоэнергетическое состояние �ψ , � ���ℎ� связи в поле GLYCAM немогут совершить обратные переход в син -состояние, и последующая компактизация цепипродолжается за счет дальнейших необратимых переходов других связей � ���ℎ�.1381.3Роль остатка рамнозы в подвижности цепи О-антигенаСогласно результатам МД моделирования, фолдинг первоначально вытянутой структурыО-антигена происходит через обратимое (в OPLS-AA) или необратимое (в GLYCAM) образование шпильки, которое вызывает излом цепи и критическое снижение радиуса инерции (рис.
4.9, 4.10). Шпилька может быть сформирована либо в результате редкого переходав пиранозном кольце маннозы 4 C1 →1 C4 , либо через переход��/�� → �ψв связи� ���ℎ�.Последнее представляется довольно распространенным событием в обеих рассмотренных моделях, что, должно быть, связано с конкретными структурными особенностями восстановленного остатка�-L-рамнозы.Роль рамнозы в повышении подвижности полисахаридной цепи хорошо известна и ранеебыла описана для фруктовых пектинов [280, 281]. Вставка связи�-D-глюкуроновойкислоты приводит к ее изгибу∼ 90∘2-�-Rha-1в цепочке поли-(эту конформацию авторы назвалиполисахаридным кинком [280]).
Однако мы не наблюдали такого эффекта для О-антигенаSalmonella, по-видимому, из-за отличного окружения рамнозного остатка (4-�-L-Rha-1). Увеличение подвижности отрицательно заряженных цепей пектина при высоком содержаниинезаряженной рамнозы [280, 281] можно объяснить уменьшением самоотталкивания внутрицепи [282]. Для нейтральных цепей О-антигенаSalmonella увеличение гибкости цепи в местахналичия рамнозы должно иметь совершенно иную природу.Анализ состояний�ψрассматриваемых дисахаридов не показывает каких-либо струк-турных преимуществ состояния Man-Rha�ψпо сравнению с аналогичными состояниями вGal-Man или Rha-Gal. Тем не менее, конформация Man-Rhaную энергию, чем другиеанти -состояния�ψимеет более низкую свобод-в вакууме и особенно в воде (табл.
4.1), и цепьО-антигена изгибается преимущественно за счет перехода� ���ℎ�в состояние�ψ .Такимобразом, заселение этого состояния является энтропийным процессом и играет решающуюроль в разрушении высокоупорядоченной исходной спиральной конформации. Возможнойпричиной такого энтропийного усиления образования�ψсостояний в связи� ���ℎ�яв-ляется высокая подвижность кольца рамнозы. Действительно, в то время как маннозныеи галактозные кольца сохраняют свои конформации, мы наблюдаем множественные переходы кольца рамнозы, выворачивающегося в расчетах как в поле OPLS-AA, так и в полеGLYCAM (табл.
4.2). В то же время, состояние�ψсвязи�ℎ����стабилизируется обра-зованием водородной связи, которая ограничивает подвижность кольца рамнозы и, следовательно, уменьшает энтропию этого состояния. Этот эффект подтверждается в расчетахдля дисахаридов в поле OPLS-AA. В Rha-Gal в состоянии�ψразница энергий конформа-139ций 1 C4 и 4 C1 кольца рамнозы равна ∼ 45 кДж/моль по сравнению с ∼ 5.2 кДж/моль вMan-Rha (табл.
4.2).1.4Заключение о конформационой динамике цепи О-антигена враствореМы разработали две МД модели цепочки О-антигенаS. typhimuriumсеротипа B с исполь-зованием силовых полей OPLS-AA и GLYCAM и проанализировали их конформационноеповедение в растворе. Для каждого полимера разнообразие возможных конформаций цепизависит от его длины.
Этот эффект выражен даже для довольно коротких фрагментов Оантигена (1–4 тетрасахаридных звена) [30], тогда как в реальной системе молекулы могутсодержать до сотни повторяющихся звеньев [182]. В силу ограниченного вычислительноговремени МД расчетов, мы рассматривали цепь О-антигена, содержащую 12 повторяющихсязвеньев. Наша цепь была в два раза длиннее О-антигенов, рассмотренных в предыдущих модельных исследованиях [29,30]. В результате, наши модели продемонстрировали качественноновое конформационное поведение, которое не может быть выведено из анализа динамикиболее коротких олигосахаридов.В моделях в обоих полях OPLS-AA и GLYCAM мы наблюдали образование несколькихшпилек и компактных глобул. Устойчивость этих состояний определяется не только углами поворота вокруг O-гликозидных связей (�, �) и конформациями пиранозных колец, нои взаимодействием удаленных частей цепи.
Для детального изучения конформационногоповедения длинной цепочки О-антигена мы провели анализ каждого из этих факторов поотдельности. Сначала, чтобы не учитывать вклад дальних взаимодействий, мы рассмотрелидисахаридные фрагменты основной цепи О-антигена как отдельные молекулы и проанализировали ландшафт свободной энергии в координатах (�, �) методом PMF по результатам продолжительный МД расчетов (1 мкс в вакууме и 100 нс в воде).
Глобальный минимум для всехдисахаридов в обоих силовых полях соответствует син -конформации O-гликозидных связей.Также заселены анти -конформации с более высокой энергией, что хорошо соответствует полученным ранее результатам [28–30]. При моделировании дисахаридов мы наблюдали толькоколичественные различия между моделями в полях OPLS-AA и GLYCAM.
Наиболее выраженная разница между используемыми силовыми полями связана со степенью заселенностисостояния �ψ связи � ���ℎ�, которая значительно выше в модели GLYCAM.Глобальные минимумы свободной энергии, полученные для моделей дисахаридов в поляхOPLS-AA и GLYCAM, были использованы для построения начального состояния для моде-140лирования динамики длинной цепочки О-антигена.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
