Диссертация (1103954), страница 23
Текст из файла (страница 23)
На различных этапах работы нами были рассмотрены какR-мутанты форм Re- и Ra-, так и гладкие S-формы (рис. 4.1). Структура центрального олигосахарида и полисахарида О-антигена этой молекулы, были рассмотрены в раннем модельном исследовании [274]. Структура Re-LPS была получена в нашей лаборатории с помощьюметодов масс-спектрометрии (см. раздел 6.4). Так как О-антиген является наиболее объемнойи вариабельной частью ЛПС, то, в первую очередь, нами было проведено детальное исследование его локальной и глобальной конформационной подвижности в растворе (раздел 1).Далее, нами была проведена валидация параметров модели для липидной части ЛПС (раздел 2) и корректировка отсутствующих в силовом поле параметров для фрагментов полярнойголовки липида А и центрального олигосахарида (раздел 3).
Полученные параметры былииспользованы для создания моделей ЛПС-молекул (раздел 4), ЛПС-мицелл (раздел 5) иЛПС-содержащих мембран (раздел 6).113114Рис. 4.1: Структура ЛПС S. typhimurium, используемая для модельных исследований.1151МоделированиеповедениясвободногоО-антигенавраствореПространственная структура длинной полисахаридной цепи определяется конформациямиО-гликозидных связей между остатками, а также конформациями пиранозных колец (см.раздел 1.4.1 главы 2). Для лучшего понимания механизмов, лежащих в основе конформационной динамики длинной О-антигенной цепи, мы провели детальное исследование пар углеводных остатков, образующих основную цепь О-антигена:(1→4)-�-LRha и�-LRha-(1→3)-�-DGal,�-DGal-(1→2)-�-DMan, �-DMan-далее обозначаемых для простоты как Gal-Man,Man-Rha и Rha-Gal.1.1Конформационный анализ дисахаридных фрагментовКаждый дисахаридный фрагмент был рассмотрен нами как отдельная молекула (рис.
4.2,верхний ряд), для которой нами были проведены расчеты распределения свободной энергии в вакууме (рис. 4.2) и в водном растворе (рис. 4.3), используя метод PMF (см. раздел 1.4.2 главы 2). В ходе МД расчетов для дисахаридных молекул наблюдались измененияконформаций пиранозных колец, а также повороты остатков вокруг угловных расчетах помимо энергетически предпочтительныханти -состояния(�, �).син -конформаций,В вакуум-также заселеныи набор дополнительных состояний, определяемый индивидуальным стро-ением соответствующих остатков. Добавление воды в рассматриваемую системы влияет нарезультирующие распределения свободной энергии за счет разрушения внутримолекулярных водородных связей и образования новых водородных связей с молекулами воды.
Такимобразом, молекулы дисахаридов в водном окружении существуют предпочтительно в конформациях, соответствующих бассейну минимальной энергии для молекул в вакууме. Намибыла проведена подробная классификация и анализ энергетически выгодных конформацийдисахаридов на основании значений свободной энергии заселенных состояний. Количественные данные приведены в табл. 4.1.116Таблица 4.1: Относительные значения свободной энергии конформаций дисахаридов, полученные методом PMF в вакууме и водном растворе для силовых полей OPLS-AA и GLYCAM.OPLS-AAGLYCAMкоординаты∆G, кДж/молькоординаты∆G, кДж/мольвакуумводавакуумводаα-DGal-(1→2)-α-DManдоп.антисиндоп.антисиндоп.антисинLL(−25, −22)0.09.7 ± 0.4RR——LR(−33, 40)1.9 ± 0.1Aψ(−17, 173)17.3 ± 0.6Aϕ(−175, −10)26.9 ± 0.7S1(62, 72)18.9 ± 0.3LR(−31, 45)0.00.0LL(−45, −10)3.9 ± 0.12.2 ± 0.6RR(34, 23)8.0 ± 0.4Aψ(−12, −177)18.7 ± 0.3Aϕ(−177, 2)15.5 ± 0.2S2(−54, 153)S3—14.6 ± 0.2S4(−138, 46)24.7 ± 0.6S5(55, 60)11.7 ± 0.3RR(46, 29)0.00.0RL(38, −40)6.6 ± 0.4LL(−25, −28)11.9 ± 0.6Aψ(32, 161)16.0 ± 0.2Aϕ(170, 12)20.4 ± 0.3S6(−170, 63)24.0 ± 0.5——0.0(−29, −17)0.00.0(23, 25)4.2 ± 0.210.7 ± 1.5(−29, 36)4.9 ± 0.56.6 ± 1.315.7 ± 0.215.6 ± 0.6—(−28, 170)—(−164, −10)——α-DMan-(1→4)-α-LRha19.8 ± 0.3——(−38, 4)0.00.0———5.5 ± 0.3(36, 25)11.0 ± 0.27.1 ± 0.211.9 ± 0.6(−29, −176)7.2 ± 0.18.7 ± 0.4—(−173, −3)—(−53, 156)—(50, −150)———(61, 52)α-LRha-(1→3)-α-DGal27.7 ± 0.721.0 ± 0.4—7.7 ± 0.18.7 ± 1.414.2 ± 0.2———(48, 17)0.00.03.9 ± 0.7———9.8 ± 0.6(−35, −15)16.8 ± 0.212.9 ± 0.5(33, 163)15.7 ± 0.118.1 ± 0.6(172, 11)25.2 ± 0.415.6 ± 0.9(−167, 55)29.9 ± 0.8———24.7 ± 0.6——1171.1.1Конформации О-гликозидных связейДля обоих полей OPLS-AA и GLYCAM функции распределения микросостояний в фазовомпространстве (�, �) очень похожи (рис.
4.2). Нами было выявлено несколько типов энергетически выгодных конформаций, обычно наблюдаемых в дисахаридах [28–30, 224].Рис. 4.2: Распределения свободной энергии, рассчитанные методом PMF, в координатах двугранных углов (�, �) для дисахаридов Gal-Man, Man-Rha и Rha-Gal в вакууме при температуре 500 K. Расчеты проводились в силовых полях OPLS-AA (верхний ряд) и GLYCAM (нижний ряд). Буквами отмечены локальные энергетические минимумы (рис. 4.4). На рисунках (B,E) черными линиями отмечены одномерные срезы распределения энергии, для которых проводилось сравнение с ab initio расчетами (рис.
4.5).118Рис. 4.3: Распределения свободной энергии, рассчитанные методом PMF, в координатахдвугранных углов(�, �)ре при температуредля дисахаридов Gal-Man, Man-Rha и Rha-Gal в водном раство-300 K. Расчеты проводились в силовых полях OPLS-AA (верхний ряд) иGLYCAM (нижний ряд). Буквами отмечены локальные энергетические минимумы (рис. 4.4).1.1.1.1Син -конформации.Как и в предыдущих модельных и экспериментальных ис-следованиях, глобальные минимумы свободной энергии для всех дисахаридов соответствуютстерически выгоднымсин -конформациям углов (�, �) [28,29]. В этих состояниях пиранозныекольца максимально удалены друг от друга (рис.
4.4 A). В зависимости от знаков значенийдвугранных углов мы обозначаемэнергии как��, ��, ��и��,син -конформации внутри бассейна глобального минимумав соответствии с типом образуемой спирали (левой L илиправой R).Наиболее заселенной конформацией для Gal-Man является состояниедвумя другими стерически выгодными конформациями:(рис. 4.2 D), и��,��,��.Оно окруженозаселенным в поле GLYCAMзаселенным в поле OPLS-AA, и становящимся предпочтительным в при-сутствие воды (рис. 4.2 A). Переход между��и��состояниями является часто встреча-ющимся событием, так как абсолютные значения свободной энергии этих состояний очень119близки (табл. 4.1).
Глобальный энергетический минимум Man-Rha в моделях в обоих поляхможно интерпретировать как конформацию�� (рис. 4.2 C,E). �� состояние также довольносильно заселено в расчетах, проведенных в водном окружении, и становится предпочтительным для Man-Rha в поле GLYCAM. Состояние��возникает в качестве отдельногоэнергетического минимума в водных расчетах в поле GLYCAM, но имеет довольно высокуюэнергию. Глобальный минимум свободной энергии для Rha-Gal (рис.
4.2 C,F) соответствуетконформации��,в то время как состояние��заселено слабо.BACРис. 4.4: Примеры характерных конформаций дисахаридов для состояний, соответствующихглобальному минимуму энергии (A; Gal-Man,��),анти -конформации (B; Man-Rha, �ψ ) идополнительной локально выгодной конформации, стабилизируемой образованием водородной связи (C; Man-Rha,1.1.1.2�2 ).Анти -конформации.Помимо конформаций, находящихся в бассейне глобаль-ного энергетического минимума, в расчетах были также наблюдаются несколько других значительно заселенных состояний. В первую очередь, для каждого дисахарида существуютдва энергетических минимума для значений угловных около180∘ ),�или�ванти -конформации (т.
е. рав-что соответствует “развернутой” конформации (рис. 4.4 B), в которой пи-ранозные кольца контактируют друг с другом за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий.Анти -конформации часто встречаются в дисахаридах различной природы [28, 223, 224, 256].Далее мы будем обозначать их как�ϕи�ψ . �ϕсостояние в Gal-Man и�ϕ , �ψсостоянияв Rha-Gal (рис.
4.2 A,D,C,F) дополнительно стабилизируются образованием водородной связи между атомами O6 галактозы и O3 маннозы, и атомами O6 рамнозы и O2 галактозы,соответственно (рис. 4.4). Образование водородных связей ванти -состояниях ранее наблю-далось для некоторых других дисахаридов [28]. Для всех рассмотренных моделей состояния�ψболее заселены, чем конформации�ϕ .Заметим, что энергетические барьеры между со-стояниями, как правило, выше в моделях GLYCAM: например, в Rha-Gal барьер перехода120�� → �ψв модели OPLS-AA равенего величина составляет27.4 ± 0.6и34.2 ± 1.229.2 ± 0.620.8 ± 0.3кДж/моль, тогда как в модели GLYCAMкДж/моль, а барьер�� → �ϕдля Rha-Gal составляеткДж/моль в OPLS-AA и GLYCAM, соответственно.Наиболее заметное различие между моделями дисахаридов в поле GLYCAM и OPLS-AAкасается заселенности состояния�ψв расчетах для Man-Rha, которое намного больше за-селено в силовом поле GLYCAM (рис.
4.2 В,Е). В самом деле, значение свободной энергииконформации�ψв поле GLYCAM примерно на4 kTниже, чем в поле OPLS-AA (табл. 4.1).Кроме того, хотя энергетические барьеры перехода из глобального минимума в состояниеблизки в обеих моделях (20.8± 0.1и17.7 ± 0.2 кДж/мольв OPLS-AA и GLYCAM, соответ-ственно), барьер обратного перехода намного ниже в поле OPLS-AA (∼время как в поле GLYCAM он составляет ∼�ψ2.1 кДж/моль,в то10.5 кДж/моль). Как мы покажем в разделе 1.2.2,эта разница существенно влияет на конформационное поведение длинной О-антигенной цепочки, так как связь между остатками маннозы и рамнозы имеет тенденцию необратимопереходить в состояние�ψпри моделировании длинной цепи.Для проверки полученных результатов мы провели расчет профиля потенциальной энергии Man-Rha при фиксированном значении� = 0� = −20∘ ,и затем при фиксированном значениив обоих силовых полях (рис.
4.2 B,E; черные линии) и сравнили их с результатамивычисленийab initio(протокол такого расчета подробно описан в разделе 1.2 главы 2). Хотяв обоих силовых полях энергетические профили для фиксированного углана результирующуюab initio�очень похожиэнергию (рис. 4.5 A), мы наблюдаем существенное различиедля профилей энергии, полученных при фиксированном значении угламом деле, локальный минимум энергии, соответствующий состоянию�(рис. 4.5 B). В са-�ψ , ярко выражен длярезультатов МД расчетов, в то время как он практически отсутствует в профилеэнергии. Более того, уровень энергии состояния�ψab initioв модели Man-Rha в поле GLYCAM вдва раза ниже, чем в поле OPLS-AA.
Заниженное значение энергии�ψ -состоянияв полеGLYCAM (рис. 4.2 Е) приводит к наблюдаемой повышенной заселенности соответствующейконформации, что, скорее всего, является артефактом.121Рис. 4.5: Профили потенциальной энергии для связи Man-Rha, полученные в ab initio вычислениях (черные точки) и в расчетах МД в силовых полях OPLS-AA (синяя линия) иGLYCAM (красная линия) (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
