Диссертация (1103763), страница 13

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 13)

Толстая желтая линия показывает среднее количество искривленныхпротофиламентов. Внизу помещена увеличенная вставка, показывающая график вблизи моментакатастрофы.Количество ГТФ-димеров в микротрубочке также в значительной степени флуктуирует(Рис. 42), и иногда ГТФ-колпачок становится очень небольшим, но такие события необязательно приводят к катастрофе по причине существования стабильного состояниямикротрубочки без ГТФ-колпачка.Для того, чтобы более детально понять, какие события предшествуют катастрофе, всеиспытавшие катастрофу микротрубочки были «синхронизированы» в момент катастрофы.Временные зависимости для рассмотренных микротрубочек были сдвинуты по осивремени так, чтобы момент катастрофы каждой отдельной микротрубочки пришелся навремя 0 секунд (вставки на Рис.

41, Рис. 42)83Рис. 42. Кинетика изменения количества ГТФ-димеров перед катастрофой. Каждая из отдельныхтонких кривых показывает индивидуальный расчет для одной микротрубочки, со временем в нулесоответствующим началу катастрофы. Толстая оранжевая линия показывает усредненную по всемрасчетам зависимость приращения длины микротрубочки от времени, N = 52. Толстая желтаялиния показывает среднее количество ГТФ-димеров в микротрубочке. Внизу помещенаувеличенная вставка, показывающая график вблизи момента катастрофы.Интересно, что в результате не были обнаружены значимые изменения в размере ГТФколпачка непосредственно в момент катастрофы по сравнению с размером до наступлениякатастрофы.

Количество же искривленных протофиламентов на конце микротрубочек,напротив, резко увеличивалось перед катастрофой. Отсюда был сделан вывод, чтокатастрофе предшествует обратимое образование большого количества изогнутыхпротофиламентов на конце микротрубочки, а не резкая потеря ГТФ-колпачка.Отталкиваясь от этого вывода, было решено проверить, есть ли связь между кинетикой«старения» микротрубочки и частотой образования искривленных протофиламентов.

Врезультатебылообнаружено,чтовероятностьвозникновенияизогнутых84протофиламентов постепенно увеличивается по мере роста микротрубочки (Рис. 43) ивременная характеристика этих двух процессов была схожей (ср. Рис. 28Б).А.Б.Рис. 43. А. Пример растущей микротрубочки с отклоняющимися протофиламентами (помеченыстрелочками).

Б. Кинетика изменений в конфигурации микротрубочки с момента начала роста. Аименно, частоты встречаемости в популяции микротрубочек таких, у которых 10 и болееотклонившихся протофиламентов (серый цвет, левая ось ординат), у которых 2-4 отклонившихсяпротофиламентов (зеленый цвет, правая ось ординат, относительный размер ГТФ-колпачка(голубой цвет, правая ось ординат). Графики построены на основании N = 79 расчетов динамикимикротрубочек. Толстые синяя и зеленая линии – результат аппроксимации экспоненциальнойзависимостью. Толстая черная линия – результат аппроксимации с помощью функции Хилла: Н =A • th/(τh + th) с параметрами τ = 185.4 ± 50.4 с, h = 4.2.Таким образом, образование отогнутых протофиламентов является обратимым событием скинетикой накопления 10-13 явлений близкой к кинетике «старения».85ГЛАВА 4.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ4.1Броуновская динамика в моделировании микротрубочкиМолекулярный механизм переключения микротрубочки между фазами роста иукорочения остается до сих пор одним из нерешенных вопросов в области изучениямитотическогопредоставилиделенияклетки.убедительныеПредыдущиедоказательстваэкспериментальныеважностиГТФ-колпачкаисследованиявпроцессевозникновения катастрофы. Однако до сих пор все еще не удалось численно воссоздатьвесь спектр экспериментальных наблюдений свойств микротрубочки с помощью единоймодели и с использованием одного набора параметров, что указывает на наличиесущественных пробелов в понимании этого процесса. Многие из этих противоречийпоявились относительно недавно, благодаря вновь возросшему интересу к процессу«старения» микротрубочки – медленному увеличению частоты катастроф в первыенесколько минут роста микротрубочки [43,44,48,42].Созданная модель способна впервые описать экспериментальные свойства микротрубочкив рамках одного набора параметров: 1) скорости роста и укорочения микротрубочки вдиапазоне концентраций 6-20 мкМ (Рис.

22, Рис. 25); 2) характерные формы растущих иукорачивающихся концов микротрубочки (Рис.23, Рис.24); 3) численныехарактеристики «старения» микротрубочки (Рис. 28, Рис. 29); 4) слабую зависимостьчастоты катастроф от концентрации растворимого тубулина (Рис. 27Б);5) время донаступления катастрофы после удаления растворимого тубулина из камеры (Рис.

39). Также остаются в силе результаты моделей относительно развиваемой деполимеризующейсямикротрубочкой силы, основанные на тех же потенциалах взаимодействия [84,82,39].Используемый в нашей работе подход в дальнейшем может быть улучшен последополнительной детализации, так как в настоящей версии имеется несколько упрощений идопущений. Данная модель содержит ряд предположений, согласно которым 1) гидролизГТФ полностью случаен и может происходить без ограничения в любом ГТФ-димере вмикротрубочке 2) к ГДФ-тубулинам в стенке микротрубочки приложено изгибноенапряжение, старающееся выгнуть их наружу с образованием искривленных олигомеров,наблюдаемых на конце разбирающихся микротрубочек с помощью электронной86микроскопии.

3) Движение каждого протофиламента ограничено плоскостью.Из-за длительности вычислений в данной компьютерной реализации модели техническиневозможно рассчитать динамику микротрубочки с использованием реалистичнойконстанты гидролиза на временах, на которых наблюдаются катастрофы в эксперименте.Это ограничение существует даже несмотря на использование технологий параллельногопрограммированияисуперкомпьютерныхвычислений.Этиограничениябылипреодолены с использованием завышенной константы гидролиза и дальнейшегообратного пересчета полученных времен. Однако в дальнейшем такой анализ может бытьпроведен с использованием реалистичной константы гидролиза при условии ускорениярасчетов в ~20 раз.Другое существенное ограничение данной модели в том, что движение каждогопротофиламента ограничено в своей плоскости (Рис.

15Б), что не дает возможности учетаконфигураций с образованием двух и более поперечно связанных протофиламентов,отгибающихся от конца микротрубочки. В дальнейшем учет полностью трехмерныхконфигураций также потребует увеличения скорости расчетов.

Устранение этихограничений в будущем может расширить применение данной модели.4.2Катастрофы как результат флуктуаций в состоянии конца микротрубочкиУтвердившееся в данной области представление о механизме катастрофы заключается втом, что потеря ГТФ-тубулинов обнажает ГДФ-тубулиновую часть микротрубочки,которая нестабильна и в итоге неизбежно испытывает катастрофу (Рис. 44А), [26].

Дляскорости гидролиза 0,5 с-1, что в наших расчетах соответствует ГТФ-колпачку размером120 димеров, вероятность полной потери ГТФ-колпачка ни разу не наблюдалась врасчетах суммарной продолжительностью ~30 минут. При этом в клетке катастрофыпроисходят в течение нескольких минут.Данное расхождение предполагает, чтокатастрофа должна происходить до полной потери ГТФ-колпачка. Тот факт, чтопредыдущие модели с правилом полностью случайного гидролиза не были в состояниивоспроизвести набор экспериментальных свойств микротрубочки вместе со статистикой87катастроф, привел нас к необходимости подробнее рассмотреть молекулярный механизмкатастрофы. В данной работе не отвергается другой, тоже достаточно вероятныймеханизм индуцированного гидролиза, при котором в дополнение к описываемому здесьправилу запрещен гидролиз в крайних субъединицах протофиламента.

Однако в данноймодели при этом альтернативном правиле гидролиза не ожидается качественноеизменение результатов.Далее,приведенныйвышеанализконфигурацийконцамикротрубочкиявнодемонстрирует, что стабильность микротрубочки определяется не только ГТФ-колпачком,но и наличием изогнутых протофиламентов на конце. К примеру, модель предсказывает,что микротрубочка с тупым концом без ГТФ-субъединиц некоторое время стабильна и неиспытывает катастрофу, поскольку в присутствии растворимого тубулина вновьприсоединенные ГТФ-субъединицы стабилизируют микротрубочку.Однако, конецмикротрубочки с многими искривленными протофиламентами сильно нестабилен дажеесли он содержит ГТФ-субъединицы в количестве, как у стационарно растущего полимера(Таблица 2).Важно добавить, что во время роста конфигурация конца постоянноменяется, так как меняется и нуклеотидный состав, и количество выростов на концемикротрубочки (Рис.

41, Рис.42). В рамках данной работы предлагается механизмкатастрофы как результат совпадения многих событий, каждое из которых в отдельностине приводит к катастрофе. А именно, событий образования отогнутых протофиламентов(Рис. 44Б).88А.Б.Рис. 44. Механизм перехода микротрубочки к катастрофе.

A. Общепринятое объяснениемеханизма катастрофы, при котором случайная потеря ГТФ-колпачка немедленно приводит ккатастрофе. В результате образуются загибающиеся протофиламенты и микротрубочка начинаетбыстро укорачиваться. Б. Схема перехода к катастрофе, предложенная на основе данногоисследования. Данная работа уточняет предложенное ранее объяснение механизма катастрофы,демонстрируя что кроме флуктуаций в количестве ГТФ-димеров на конце микротрубочки,стабильность микротрубочки сильно зависит от флуктуаций ее конформации во время роста. Внашем представлении, катастрофа является результатом редкого одновременного совпадениянескольких свойств, включающих в себя образование большого количества отогнутыхпротофиламентов и расположения и количества ГТФ-димеров.4.3В основе механизма катастрофы лежат короткоживущие обратимыемолекулярные события на конце микротрубочкиВ представленной модели микротрубочки демонстрируют феномен «старения» –медленного увеличения частоты катастроф от времени, так же, как это наблюдается вэксперименте [43,44].

При анализе модели было выявлено, что «старение» не обусловленони накоплением необратимых дефектов, ни нарастающим изменением конфигурации на89протяжении всего времени роста микротрубочки. Также анализ показал, что катастрофа вмодели является результатом стохастического обратимого (а не детерменированного)процесса: действительно, микротрубочки при повторении расчета с момента, кода ониранее испытали катастрофу, вновь переходят к укорочению лишь в 90% случаев (Рис.31А). Данные результаты создают некий кажущийся парадокс: конец микротрубочки какбудто имеет «память» о предыдущем состоянии, и эта память длится несколько минут(Рис. 28),в то время как характерные времена элементарных процессов, связанных сдинамикой микротрубочки, значительно короче.

Характеристики

Список файлов диссертации