Автореферат (1103762), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Это показывает, что процесс «старения» в нашей модели не связан с накоплениемнеобратимых дефектов в стенке микротрубочки. В противном случае возникающиеизменения должны были бы сохраняться в стенке микротрубочки и удаляться от кончикапо мере его удлинения, выходя из зоны активных димеров, тем самым переставаявызывать катастрофы.Для дальнейшего анализа механизма катастрофы и проверки необратимости вызывающихее изменений, были найдены точные времена наступления катастрофы для отдельныхмикротрубочек. Затем для каждой такой траектории был выбран шаг отступления назад повремени от момента катастрофы и найдена соответствующая конфигурация.
Дляначальной «предкатастрофической» конфигурации был продолжен расчет и было найденовремя, через которое такая микротрубочка испытает катастрофу вновь. Удивительнымрезультатом явился тот факт, что даже микротрубочки, для которых расчет былпродолжен прямо с момента катастрофы, испытали немедленную повторную катастрофутолько в 90% случаев, в то время как остальные 10% продолжили удлиняться. Данный14результат указывает на то, что катастрофа является обратимым процессом даже в самыйблизкий к ее началу момент.Совместно с расчетами с различным количеством «активных» димеров, эти результатыуказывают на отсутствие накопления медленных необратимых дефектов в стенкемикротрубочки.
А так же указывают на то, что молекулярные события, приводящие ккатастрофе, проявляются на самом кончике микротрубочки, а не в ее стенке вдалеке отконца.Отсутствие медленных изменений конформации кончика микротрубочкиДругой альтернативный вариант объяснения «старения» заключается в непрерывномувеличении заостренности кончика микротрубочки со временем (разница в длине междусамым коротким и самым длинным протофиламентом в микротрубочке).Б.А.Рис. 5. А. Изменение заостренности кончика микротрубочки при запуске расчетов изначальных состояний с различной заостренностью.
Слева направо в каждой из четырехвременных рамок: заостренный конец, тупой конец, стационарное состояние. Khydrol = 0.5 с-1 иконцентрация тубулина 10 мкМ. Видно, что через ~4 секунды все три микротрубочки имеютсопоставимую степень заостренности. Б. График изменения заостренности кончикамикротрубочки при начале расчета из состояний с различной заостренностью.
Каждая криваяусреднена по N=32 расчетам.Были проведены расчеты, в которых были различные начальные значения заостренностикончика при неизменном количестве ГТФ-димеров на конце (Рис. 5): заостренный, тупой,а так же незначительно изрезанный концы микротрубочки (соответствует стационарному15состоянию заостренности при полимеризации). В результате было показано, что значениезаостренностимикротрубочкивмоделиустойчиво:концыстремятсяпринятьстационарное состояние вне зависимости от начальной конфигурации.Таким образом, данная модель не подтвердила ни одной из существующих гипотез,призванных объяснить феномен «старения».Влияние конфигурации кончика микротрубочки на ее стабильностьПромежуточное стабильное состояние микротрубочки в отсутствии ГТФ-колпачкаДля более детального понимания механизма катастрофы и механизма «старения»микротрубочки была исследована роль ГТФ-колпачка.
С момента начала полимеризациитубулина размер ГТФ-колпачка в модели быстро начинал расти и достигал стационарногосостояния через 4-7 секунд, с количеством ~120 ГТФ-димеров на микротрубочку приконцентрации 10 мкМ тубулина (Рис. 6А). Полученные в модели предсказания лежатвнутри диапазона как экспериментальных, так и теоретических оценок.
Стационарныйразмер ГТФ-колпачка увеличивается пропорционально концентрации, но характерноевремя достижения стационарного состояния меняется мало (1.9 ± 0.1 с для 10 мкМ, Рис.6Б).А.Б.Рис. 6. А. Полное количество ГТФ-димеров в микротрубочке как функция времени дляконцентраций тубулина 10 и 20 мкМ, аппроксимации экспоненциальными функциями. Б.Стационарное значение ГТФ-колпачка микротрубочки и характерное время достижениястационарного значения(при начале расчетов с тупым концом) для различных концентрацийтубулина. Данные представлены средним значением и нанесена ошибка среднего. Каждойточке соответствует N = 32 расчетов, линии – результат линейной аппроксимации.Далее,чтобыпротестироватьстабилизирующие16свойстваГТФ-колпачка,былисмоделированыэкспериментысудалениемрастворимоготубулина,вкоторыхмикротрубочки выращивались в растворе с постоянной концентрацией ГТФ-тубулина,после чего тубулин удалялся путем замещения буферного раствора и измерялось время доначала деполимеризации микротрубочек.
В расчетах концентрация тубулина мгновенноснижалась до 0 мкМ после 6.5 секунд полимеризации. В модели микротрубочкииспытывали катастрофу с некоторой задержкой, близкой к наблюдаемой в эксперименте.Вслед за убиранием тубулина микротрубочки переставали расти и переходили в состояниемедленного укорочения, только спустя какое-то время сменяющегося фазой быстройразборки (Рис. 7).Таким образом, разборка происходила не за счет быстрого разрыва поперечных связей ипоследующегоразрывапродольных,когдадиссоциируютцелыеолигомеры,апреимущественно посредством отрыва одиночных димеров. После удаления тубулинаразмер ГТФ-колпачка уменьшался экспоненциально, как и ожидается в случае случайногогидролиза.А.Б.Рис. 7.
Примеры зависимостей длины микротрубочки (серые кривые) и количества ГТФтубулинов (черные кривые) от времени в расчетах с быстрым удалением тубулина. Ростмикротрубочек происходил в течение ~6 секунд при константе гидролиза Khydrol = 0.5 с-1 иконцентрации тубулина 10 мкМ (А.) и 20 мкМ (Б.), после чего концентрация тубулинапринимала нулевое значение (момент падения концентрации тубулина до 0 мкМ отмеченчерной стрелкой).17Удивительно, но катастрофа происходила только через 1,7±0,5 секунд после полнойпотери ГТФ-колпачка, и ее наступление было связано с образованием формы раскрытоговенчика (Рис. 8, 3.3с). Этот результат указывает на то, что микротрубочка можетсуществовать некоторое время без ГТФ-колпачка, не разбираясь.
А также на то, что навероятность наступления катастрофы влияет не только размер ГТФ-колпачка, но иконфигурация конца микротрубочки.Влияние искривленных олигомеров на переход к катастрофеДля исследования влияния отгибающихся олигомеров на конце микротрубочки на еестабильность были сделаны расчеты при нулевой концентрации тубулина с двумяразными начальными конфигурациями: когда трубочка без ГТФ-димеров не имелаизогнутых протофиламентов на конце, и когда все 13 протофиламентов были отогнуты наконце микротрубочки.Темикротрубочки,у которыхотогнуты быливсе13протофиламентов, тут же начинали разборку (N = 32), в то время как в случае с тупымконцом катастрофа наступила только через ~2 секунды, что показывает явный эффектизогнутых протофиламентов на снижение стабильности микротрубочки.Рис.
8. Конфигурации микротрубочекв различные моменты времени послеудаления тубулина (0 секунд).Начальная концентрация тубулина 10мкМ, Khydrol = 0.5 с-1.18Чтобы проверить, являются ли искривленные на конце микротрубочки протофиламентыфактором, приводящим к катастрофам, была оценена вероятность наступлениякатастрофы у микротрубочек с различным сочетанием и количеством искривленныхпротофиламентов в присутствии 10 мкМ растворимого тубулина.
В случае конфигурациис тупым концом катастрофа не наступила ни в одном из 32 расчетов в течение 0,5 секунднаблюдения. Тогда как отгибание хотя бы двух протофиламентов приводило кнаступлению катастрофы в 21-26 случаях из 32. Данный анализ конфигураций показывает,что искривленные олигомеры на конце микротрубочки имеют дестабилизирующийэффект.Связь между процессом «старения» и накоплением искривленных протофиламентовДля того чтобы понять, какие события предшествуют катастрофе, все испытавшиекатастрофу микротрубочки были «синхронизированы» в момент ее наступления. Такимобразом, временные зависимости для рассмотренных микротрубочек были сдвинуты пооси времени так, чтобы момент катастрофы каждой отдельной микротрубочки пришелсяна время 0 секунд.Рис.
9. Частота встречаемости микротрубочек, у которых 10 и более отклонившихсяпротофиламентов (черный цвет, левая ось ординат), относительный размер ГТФ-колпачка(серый цвет, правая ось ординат). Графики построены на основании N = 79 расчетовдинамики микротрубочек. Толстая серая линия – результат аппроксимации экспоненциальнойзависимостью. Толстая черная линия – результат аппроксимации с помощью функции: H=A*th/(τ + th) с параметрами τ = 185.4 ± 50.4 с, h = 4.2.19В результате не были обнаружены изменения в размере ГТФ-колпачка непосредственно вмомент катастрофы по сравнению с размером до наступления катастрофы. Количество жеискривленных протофиламентов на конце микротрубочек, напротив, резко увеличивалосьперед катастрофой в среднем от 3-4 до 10-12.
Отсюда был сделан вывод, что катастрофепредшествует обратимое образование большого количества изогнутых протофиламентовна кончике микротрубочки, а не резкая потеря ГТФ-колпачка. Более того, былообнаружено, что вероятность возникновения изогнутых протофиламентов постепенноувеличивается по мере роста микротрубочки с характерным временем, схожим современем увеличения частоты катастроф (Рис. 9).Таким образом, частота возникновения искривленных протофиламентов в популяциимикротрубочек растет со временем.
Также было показано, что характерная временнаяконстанта этой зависимости близка ко временной константе роста частоты катастроф(~160 c). Этот результат указывает, что возникновение искривленных олигомеров можетлежать в основе молекулярного механизма «старения» микротрубочки.Глава 4 содержит обсуждение результатовВ основе механизма «старения» лежат короткоживущие обратимые молекулярныесобытия на кончике микротрубочкиВ представленной модели микротрубочки демонстрируют феномен «старения» –медленное (~150-200с) увеличение частоты катастроф со временем, так же, как этонаблюдается в эксперименте.
Однако при анализе модели было выявлено, что «старение»не обусловлено каким-либо медленным процессом: ни накоплением необратимыхдефектов, ни нарастающим изменением конфигурации на протяжении всего временироста микротрубочки. Более того, характерные времена элементарных процессов,связанных с динамикой микротрубочки, значительно короче, чем характерное время«старения». Например, частота обмена субъединиц на конце микротрубочки как в модели,так и в эксперименте, имеет характерный временнóй масштаб порядка миллисекунды. Тотже по порядку величины временнóй масштаб соответствует времени разрыва связи междумолекулами тубулина.
Далее, хотя время гидролиза молекулы ГТФ в тубулине имеетпорядок не более секунды, оно все еще значительно меньше, чем характерное время20«старения» микротрубочки. Значит, в рассматриваемой системе все процессы протекают схарактерным временем на 2 и более порядков быстрее, чем происходит «старение».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
