Межмолекулярные взаимодействия в монослоях высокомолекулярных соединений (1103718), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Все исследования проводили в буферных растворах Трис-ЭДТА (pH = 7.4).Формирование сенсорных монослоев из аптамеров с различной длиной метиленовой цепипроходило в два этапа. Сначалана золотую поверхность сорбировался аптамер, затем свободные адсорбционные центры поверхности занимали молекулытриэтиленгликольунодекантиола, длина которых превышаетразмер молекулы аптамера св)а)б)короткой метиленовой цепьюРис.
13. Схема сравнения длины аптаме- (Рис. 13).ров (а, б) и триэтиленгликольунодекан- Процесс связывания аптамера стромбином проводили в потокетиола (в).буферного раствора (100mMТрис, 140мМ NaCl, 20мМ MgCl2, 20мМ KCl (pH = 7.4)). Контроль связыванияаптамера и тромбина фиксировали методами КМВ и НКС. Измерительныедатчики НКС помещали в специально сконструированную ячейку, через которую прокачивался буферный раствор со скоростью 20 мкл/мин. Раствортромбина объемом 250 мкл впрыскивали в прибор, и его концентрация визмерительной ячейке постепенно возрастала, достигая максимального значения через ~ 10 минут, затем буферный раствор снова плавно вытеснял раствор тромбина из ячейки. Аналогичную схему проведения экспериментаприменяли и в КМВ.Измерения на кварцевых микровесах показали, что при адсорбции тромбинана поверхность кантилевера, модифицированного аптамером с 6 метиленовыми группами, уменьшение резонансной частоты составляет 2 Гц.
В то жевремя при адсорбции тромбина на поверхность, содержащую аптамер с 24метиленовыми группами, уменьшение резонансной частоты было в два разабольше и составило 4 Гц (Рис. 14). Зависимость резонансной частоты и массыадсорбированного вещества имеет вид: 17k, где k – жесткость кварцевоmго кристалла, m – масса вещества, присоединившегося к поверхности кристалла. Из этой формулы следует, что масса тромбина, адсорбированногослоем с молекулами аптамера с короткой метиленовой цепью меньше массытромбина, сорбированного аптамером с длинной цепью. На рис. 15 приведены данные зависимости латеральных напряжений от времени сорбциитромбина этими же слоями, а также слоем, сформированным полиаденином.
При взаимодействии тромбина с монослоем, содержащим аптамер с 6метиленовыми группами, наблюдается рост стягивающих напряжений. В товремя как связывание белка с аптамером с 24 метиленовыми группами вызывает рост рассталкивающих напряжений. Взаимодействие тромбина сослоем, содержащим полиаденин, не приводит к значительному изменениюлатеральных напряжений.11322Рис. 14. Зависимости Δω(t) для слоевтриэтиленгликольунодекантиола,модифицированного: 1 – аптамерамис 6 метиленовыми группами; 2 – аптамерами с 24 метиленовыми группами при взаимодействии с тромбином.Рис.
15. Зависимости σ(t) для слоевтриэтиленгликольунодекантиола, модифицированного1 – аптамерами с 6метиленовыми группами; 2 – аптамерами с 24 метиленовыми группами; 3 –полиаденином при взаимодействии стромбином.В случае аптамера, привитого к поверхности через короткую метиленовуюцепь, последовательность нуклеотидов, способных связываться с белком,скрыта внутри слоя триэтиленгликольунодекантиола. Связывание тромбина стакой поверхностью, по-видимому, затруднено, что объясняет низкое значение массы адсорбированного вещества. Чтобы связывающий активный центрполинуклеотида был доступен для молекулы тромбина, аптамеру необходимо изменить свою конформацию.
В результате этого в слое образуются пустоты, которые стремятся схлопнуться (Рис 17 а), что должно привести к ростустягивающих напряжений.Сенсорный слой, сформированный из аптамеров с длинной метиленовойцепью, имеет активные центры, связывающие белок, над поверхностью слоятриэтиленгликольунодекантиола (рис.17 б). Это приводит к тому, что молекулы тромбина, связываясь с аптамером, отталкиваются друг от друга, и в18слое возникают расталкивающие латеральные напряжения, кинетика нарастания которых носит индукционный характер.
Доступность нуклеотидов ксвязыванию молекулами тромбина приводит к большей массе адсорбированного белка, по сравнению с поверхностью, образованной аптамером, который находится внутри слоя триэтиленгликольунодекантиола, что и следуетиз данных КМВ.абРис. 18. Модели иллюстрирующие возникновения стягивающих (а) и расталкивающих (б) напряжений между адсорбированными молекулами тромбина.Слой, содержащий молекулы полиаденина, не связывает молекулы тромбина. Этот факт подтвердили и данные КМВ, и измерение латеральных напряжений на НКС.Таким образом, механизм адсорбции тромбина из потока раствора зависитот структуры сенсорного слоя: молекулы аптамера находятся внутри монослоя триэтиленгликольунодекантиола или расположенны над его поверхностью.Глава 6.
Влияние ориентации белковых макромолекул на формированиелатеральных напряжений в слое при образовании иммунного комплекса(антиген-антитело). В главе приведены результаты изучения формированияиммунного комплекса в процессе адсорбции антигена пероксидазы хрена(ПХ) на монослойную пленку антитела иммуноглобулина козы (IgG), сформированную на золотой и кремниевой поверхностях. Рассмотрены два способасоздания на этих поверхностях монослоев из IgG: физический и химический.Физический метод заключался в следующем: сначала на золотую поверхность адсорбировался белок А, который широко известен и применяется виммуноферментном анализе, затем к поверхности, покрытой белком А, засчет аффинного взаимодействия прививался белок IgG, таким образом, чтобы активный центр антитела IgG оставался доступен для последующеговзаимодействия с антигеном ПХ.
При химическом способе слой антител IgGсоздавался на кремниевой поверхности, которую предварительно модифицировали 3-аминопропилсилатраном и глутаровым альдегидом, реакция19проходила между аминогруппами иммуноглобулина и альдегидными группами поверхности (Рис. 18).Адсорбция антигена ПХ антителом IgG, физически привитым к золотой поверхности кантилевера, вызывает формирование расталкивающих латеральных напряжений (рис. 19), за счет увеличения исключенного объема иммунного комплекса. После десорбциипероксидазы хрена в глициновомбуфере (pH = 3,0) и повторной ее адсорбции иммуноглобулином в фос1фатном буфере (рН = 7,4), значениелатеральных напряжений, во вновь2сформированном слое, были в несколько раз меньше.
Это связано стем, что в ходе удаления антигенаРис. 19. Зависимость σ(t) при адсорб- ПХ молекулы антитела IgG такжеции антителами IgG, физически при- частично десорбировались с повитыми на поверхность золота, анти- верхности.генов ПХ: 1 – первоначальная; 2 – по- В случае химической иммобилизавторная после десорбции ПХ в гли- ции иммуноглобулина на кремниевую поверхность и последующим егоциновом буферевзаимодействием с молекулами антигена ПХ в адсорбированном слое также формируются расталкивающие напряжения (Рис.
19). После десорбции ПХ в глициновом буфере и повторнойего адсорбции иммуноглобулином значения латеральных напряжений вовновь образовавшемся слое практически не изменились по сравнению созначениями, полученными в ходепредыдущей иммунной реакции(отклонение воспроизводимостине превышало 3 %).Значения латеральных напряже1ний в слое, сформированном в2процессе адсорбции антигенов ПХантителами IgG, физически иммобилизованными на поверхности Рис.
20. Зависимость σ(t) при адсорбзолота, в полтора раза больше, ции антителами IgG, химически привичем латеральные напряжения в тыми на поверхность кремния, антигеслое, образованным в результате нов ПХ: 1 – первоначальная; 2 – повзаимодействия ПХ с поверхно- вторная после десорбции ПХ в глицистью, на которую прививка имму- новом буференоглобулина осуществлялась химическим способом. Аффинное связывание иммуноглобулина с белком А,находящимся на поверхности золота, обеспечивает такую пришивку антител,20при которой активные центры молекул IgG, способные связывать антигеныПХ, остаются открытыми. При химической прививке иммуноглобулина, частьсвязывающих центров антитела конформационно затруднена для иммуннойреакции с ПХ из-за взаимодействия с поверхностью кремния.
В результате,при образовании иммунного комплекса увеличение исключенного объемаслоя в этом случае меньше, чем при физической иммобилизации поверхности. Тем не менее, химическая прививка иммуноглобулина позволяет проводить анализ связывания антигена с антителом после разрушения иммунного комплекса, в то время как использование слоя, полученного физическойпрививкой IgG, не позволяет проводить повторный анализ.Таким образом, поверхностный слой, полученный химической прививкой антител IgG, в отличие от поверхности с физически иммобилизованным слоемиммуноглобулина, обладает уникальным свойством: он может быть многократно использован для сорбции и десорбции антигенов ПХ, что позволяетприменять его как регенерируемое сенсорное покрытие.Выводы1.На примере двух модельных систем лигандов: бис-4-(2-пиридилметиленаминофенил)-дисульфидаи4’-(12-меркаптододеканилокси)[2,2,’;6’,2’’]-терпиридина была установлена взаимосвязь между структуроймолекул, формирующих адсорбированный слой, и природой возникающих внем латеральных напряжений.2.Установлено, что адсорбция поликатиона 4-ВП отрицательно заряженной поверхностью происходит за несколько минут, в то время как формирование структуры полимерного слоя и релаксация внутренних напряжений внем занимает часы.
Создана методика контроля релаксации напряжений вадсорбированных полиэлектролитных пленках на заряженных поверхностяхзолота и кремния.3.Впервые, основываясь на значениях латеральных напряжений, быларассчитана энергия взаимодействия (водородных связей) между комплементарными звеньями молекулы ДНК, которая коррелирует со значением,полученным исходя из теории молекулярных орбиталей. Для полинуклеотидов, способных формировать вторичную структуру на поверхности золота,впервые предложен тримолекулярный механизм образования двойной спирали ДНК.4.Впервые сенсорным слоем, состоящим из аптамера и триэтиленгликольунодекантиола, была проведена адсорбция тромбина, находящегося вдвижущемся буферном растворе.
Установлено, что механизм адсорбциитромбина из потока зависит от структуры сенсорного слоя: молекулы аптамера находятся внутри монослоя или расположены над его поверхностью.Разработан способ создания селективного рецепторного слоя на основе ап-21тамеров и триэтиленгликольунодекантиола для определения тромбина врастворе.5.Установлено, что поверхностный слой, полученный химической прививкой антител, в отличие от поверхности с физически иммобилизованнымслоем антител, обладает уникальным свойством: он может быть многократно использован для сорбции и десорбции антигенов ПХ. Предложена методика создания слоя антител на поверхности кантилевера, пригодного длямногократного использования в качестве биосенсора.Основное содержание диссертационной работы изложено в следующихпубликациях:1.Gorelkin P.V., Mukhin D.S., Majouga A.G., Romashkina R.B., BeloglazkinaE.K., Yaminsky I.V., Zyk N.V.
New self assembled coated cantilever for histidineprotein immobilization // Mendeleev commun., 2010, Vol. 20, P. 329 – 331.2.Горелкин П.В., Киселев Г.А., Мухин Д.С., Kim Т.S., Kim S.K., Lee S.M.,Яминский И.В. Использование биоспецифических реакций для созданиявысокочувствительных биосенсоров на основе наномеханическихкантилеверных систем // Высокомолек. cоед. Сер. А, 2010, Т. 52, № 10, С.1768–1779.3.Beloglazkina E.K., Majouga A.G., Zyk N.V., Rakhimov R.D., Yaminsky I.V.,GorelkinP.V.,KiselevG.A.,KutateladzeA.G.Bis-(4-(2pyridylmethyleneiminophenyl))disulfide — A chelating ligand capable of selfassembly on gold surface and its complexes with M(BF4)2 and M(ClO4)2; M –Co, Cu and Ni.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
