Лазерная спектроскопия компонентов светоиндуцируемой ферментативной реакции (1103530), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Анализ всех полученных результатовпроведен автором лично.КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВо введении дано краткое обоснование актуальности работы, сформулированыцель и задачи, научная новизна, практическая значимость и защищаемые положенияработы, приведено краткое содержание каждой из глав диссертации.Первая глава является обзорной. В разделе 1.1 описаны теоретические основыиспользуемых в работе экспериментальных методик лазерной КР спектроскопии и методаспектроскопииоптическогоэффектаКерра,индуцированногокомбинационнымрезонансом (RIKES).В разделе 1.2 обсуждены строение и функции белков. Показано, что белки с точкизрения структуры являются многоуровневыми системами, при этом состояние белковоймолекулы на каждом из уровней определяется всеми предыдущими.
Важную роль в7формировании структуры белковой молекулы и в ее функционировании играетвзаимодействие молекул белка с молекулами растворителя.В этом же разделе обсуждаются основы ферментативных реакций. Для изучениядинамических характеристик структуры большинства ферментов и исследованиявзаимосвязи структура-функция с использованием метода вспышки необходимоприменение светочувствительного субстрата-регулятора.
Отмечено, что на сегодняшнийдень метод подготовки светочувствительного субстрата-регулятора в необходимой формедля реализации светоиндуцируемой ферментативной реакции не охарактеризован.В разделе 1.3 обсуждается применение различных методов спектроскопии приисследовании биомолекул, в частности, обсуждается возможность изучения структурыбиополимеров с использованием КР спектроскопии. Показано, что лазерная КРспектроскопия является мощным инструментом для определения вторичной структурыбиополимеров.
Замечено, что при исследовании водных растворов биополимероввозникает проблема наличия интенсивного широкополосного фона, природа которого недо конца ясна.В этом же разделе обсуждается проблема низкочастотных колебаний в белках.Колебания субглобул белка друг относительно друга могут играть важную роль в егофункционировании. Оценки показывают, что частота этих колебаний лежит в областинизких частот (< 100 см-1). Наблюдение данных колебаний в водных растворах белковзатруднено. Многими исследователями делается вывод о демпфировании этих колебанийводным окружением. В то же время, теоретические оценки этого явления даютнеоднозначные результаты. Поэтому вопрос влияния растворителя на низкочастотныеколебательные резонансы является весьма актуальным.В заключение на основании анализа литературы делается вывод об актуальностинастоящего диссертацонного исследования.Втораяиспользованныхглававпосвященаработе,описаниюособенностейэкспериментальныхполученияипервичнойустановок,обработкиэкспериментальных данных, а также описанию особенностей получения и приготовленияобразцов.
Изложены основы примененных в работе методов вычитания фонового сигналаиз КР спектров, преобразования НЧ КР спектров, а также метода сравнения КР спектрови спектров поглощения.8В работе использовалось шесть различных лазерных источников, параметрыкоторых приведены в диссертационной работе.Третья глава является оригинальной и посвящена результатам собственныхисследований.
В ней обсуждаются особенности широкополосного фона в КР спектрахбиомолекул. Показано, что начальные интенсивности широкополосного фона в КРспектрах растворов белка и белкового комплекса различаются во столько же раз, восколько молекулярная масса белка и белкового комплекса (Рис.1).
При этом изменениевторичной структуры модельного полипептида поли(L-лизина) влияет как на начальнуюинтенсивность широкополосного фона, так и на временные характеристики кинетикфотообесцвечивания (Рис. 2). В то же время различия характеристик широкополосногофона в КР спектрах нативного и денатурированного белка-фермента лежат в пределахошибки эксперимента.I, отсчеты/с/мВтI, отсчеты/с/мВт0.300.250.200.150.1010.050.000.10501001502002503000Время, с50100150200250300Время, сРис. 1. Кинетики фотообесцвечивания барназы(квадраты),комплексабарназа-барстар(кружки) и растворителя (треугольники).Мощность возбуждения 500 мВт, времянакопления сигнала в одной точке 5 с,концентрации барназы и комплекса равны 25мкM.Рис. 2. Кинетики фотообесцвечивания водныхрастворов поли(L-лизина) при pH 6,5(квадраты) и pH 13,0 (кружки) и водногораствора NaOH (треугольники).
Мощностьвозбуждения 500 мВт, время накоплениясигнала в одной точке 5 с, концентрация 30мг/мл.Размерсимволовсоответствуетэкспериментальной ошибке.На основании этих результатов сделан вывод о том, что при отсутствиифлуоресцирующих примесей и флуоресценции растворителя широкополосный фон в КРспектрах водных растворов белков является сигналом от молекул белка. Следовательно,9наличие эффекта фотообесцвечивания растворов биополимеров свидетельствует одеструктивном воздействии видимого лазерного излучения на биомолекулы. При этомколебательные спектры растворов поли(L-лизина) и α-химотрипсина не изменяются вовремя облучения образцов видимым лазерным излучением, что свидетельствует онеизменности первичной и вторичной структуры исследованных биополимеров во времяоблучения видимым лазерным излучением.В последнем разделе данной главы представлены результаты изучения параметровсветорассеяния в растворах лазерных красителей.
Показано, что при определенныхэкспериментальныхпараметрахрегистрируемаяинтенсивностьсветорассеянияврастворах лазерных красителей может осциллировать. При этом период и амплитудаосцилляцийинтенсивностисветорассеяниярастворовкрасителейзависятотрастворителя, мощности лазерного излучения, геометрии заведения излучения в кювету играничных условий и определяются осцилляциями тепловой линзы. Поэтому осцилляцииинтенсивности широкополосного фона в КР спектрах растворов биомолекул могутвозникать вследствие осцилляций тепловой линзы, которые в свою очередь определяютсяпроцессами тепло- и массопереноса в образце.Таким образом, широкополосный фон в КР спектрах белков является сигналом отбелковых молекул, а его характеристики зависят от конформационного состояния белков,поэтому изучение этих характеристик может быть альтернативным методом полученияинформации о конформационном состоянии белков.
Отмечено, что при исследованиибиомолекул с использованием лазерного излучения видимого диапазона длин волннеобходимо учитывать возможное деструктивное воздействие лазерного излучения.Дальнейшее изучение широкополосного фона в КР спектрах растворов биомолекулможет открыть новые аспекты взаимодействия видимого лазерного излучения с этимимолекулами.Четвертая глава также является оригинальной и посвящена обсуждениюэкспериментальных результатов по изучению НЧ колебательных спектров раствора белкаметодом RIKES и определению методом лазерной КР спектроскопии влияниярастворителей на низкочастотные колебательные резонансы.Методом RIKES получены спектры воды и водного раствора белка в диапазоне от-4 до 4 см-1. В узкой части крыла Рэлея спектр водного раствора белка шире спектра воды10на 12%, что свидетельствует об уменьшении времени ориентационной релаксациикрупных молекулярных образований.
В спектре водного раствора белка по сравнению соспектром воды появляется линия в районе 3 см-1. Положение данной линии соответствуетпроведенным оценкам для субглобулярных колебаний исследуемого белка.Для смесей модельных веществ тетрахлорэтана (ТХЭ) и тетрабромэтана (ТБЭ) срастворителями диметилсульфоксидом (ДМСО) и четыреххлористым углеродом (ЧХУ)измерены серии КР спектров в зависимости от мольных соотношений компонентов. Наосновании изменений в КР спектрах смесей в диапазонах C-H валентных и изгибныхколебаний сделан вывод о формировании в смесях с ДМСО комплексов посредствомводородных связей.
В смесях с ЧХУ подобных комплексов не образуется.На основании изменений в КР спектрах смесей модельных веществ в диапазоне40-400 см-1 сделан вывод о том, что в результате взаимодействия ТХЭ и ТБЭ с ЧХУпроисходит смещение динамического равновесия между транс- и гош- изомерамимолекул ТХЭ и ТБЭ в сторону транс-конформации, тогда как в результатевзаимодействия с ДМСО происходит смещение динамического равновесия в сторонугош-конформации.Для выявления изменений в параметрах НЧ линий в КР спектрах модельныхвеществпроведеносравнениевлияния ДМСО и ЧХУ на молекулыТБЭ и ТХЭ происходит сдвиг до 4см-1 НЧ линии, соответствующейторсионномуСдвиг, смвеществ. Показано, что в результате-1спектров смесей со спектрами чистыхколебаниюотносительно С-С связи, в спектрах543210-1-2-3-42смесей ТБЭ (64 см-1) и смесей ТХЭ46810 12 14 16C ТХЭ,ТБЭ/C ЧХУ,ДМСО(94 см-1) (Рис.
3).ВвыявленосмесиТБЭуширениесоответствующейсДМСОНЧлинии,торсионномуколебанию относительно С-С связиРис. 3. Зависимости сдвигов низкочастотных линийв КР спектрах ТХЭ (95 см-1) в смесях с ЧХУ (r) и сДМСО (¯), ТБЭ (64 см-1) в смесях с ЧХУ (˜) и сДМСО (¢) от мольного соотношения компонентовсмеси.11(64 см-1), на 30%. Данное изменение может быть объяснено либо изменениемдобротности торсионного колебания, то есть изменением эффективного трения в средепод влиянием растворителя, либо, если данная линия состоит из нескольких компонентов,изменением относительной интенсивности и положения компонентов под влияниемрастворителя.Были измерены КР спектры водных растворов ацетамида при различных мольныхсоотношенияхацетамидаиводы.Выявлено, что НЧ линия в КР спектресостоиткомпонентов.изнесколькихПоказано,чтоИнтенсивность, отн.ед.ацетамидаподвлиянием воды в КР спектрах водныхрастворовацетамида1:71:171:301:56происходитизменение формы НЧ линии, причемизменение формы вызвано изменениемотносительнойкомпонентовлинии(рис.4).изменяетсявстрогомсоответствии с концентрацией, тогда какотносительнаяинтенсивностьвысокочастотных200300400500-1∆ν, смТак,интенсивность самого низкочастотногокомпонента100интенсивностиболеекомпонентовРис.
4. Серия нормированных на молярнуюконцентрациюКРспектроврастворовацетамида в воде в R(ν)-представлении приразных мольных соотношениях ацетамида иводы (указаны на рисунке). Для наглядности изспектров вычтен фон методом анализирующейокружности.возрастает с уменьшением концентрацииацетамида в воде.ДалеепроведенытеоретическиеоценкивлияниярастворителянаНЧколебательные резонансы модельного вещества. Результаты теоретических расчетовпоказывают, что уширение НЧ линий не может быть объяснено ангармонизмомсоответствующего потенциала, а влияние растворителя на НЧ колебания должнопроявляться в сдвиге соответствующих линий в спектре.Таким образом, в четвертой главе показано, что влияние растворителей нанизкочастотные колебательные резонансы модельных веществ, выражается в сдвиге,уширении и изменении формы линии.
Наблюдаемые изменения не могут быть объяснены12только изменением эффективного трения в присутствии молекул растворителя.Наблюдаемые уширения НЧ линий в КР спектрах модельных веществ могут бытьобъяснены изменением под влиянием растворителя относительной интенсивностикомпонентов этих линий.Пятая глава также является оригинальной и посвящена характеризации методалазерной подготовки светочувствительного субстрата-регулятора светоиндуцируемойферментативнойреакции,атакжеобсуждениювозможностиисследованиясветоиндуцируемой ферментативной реакции методом лазерной КР спектроскопии.Получены 4 серии спектров поглощения растворов субстрата-регулятора взависимости от дозы лазерного облучения на четырех длинах волн: 266, 308, 325, 355 нм.1.0а0.60.40.20.0транс-NPNCNP + NCцис-NPNC0.60.40.2010203040Доза облучения, МДж/моль1.0в0.4010203040Доза облучения, МДж/мольгтранс-NPNCNP + NCцис-NPNC0.8k, отн.ед.0.60.01.0транс-NPNCNP + NCцис-NPNC0.8k, отн.ед.б0.8k, отн.ед.0.8k, отн.ед.1.0транс-NPNCNP + NCцис-NPNC0.20.60.40.20.00.0010203040Доза облучения, МДж/моль010203040Доза облучения, МДж/мольРис.5.Зависимостиконцентрацийкомпонентоврастворасубстрата-регуляторасветоиндуцируемой ферментативной реакции от дозы лазерного облучения на длине волны266 нм (а), 308 нм (б), 325 нм (в) и 355 нм (г).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
