Лазерная спектроскопия компонентов светоиндуцируемой ферментативной реакции (1103530)
Текст из файла
На правах рукописиЛебеденко Степан ИгоревичЛАЗЕРНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ КОМПОНЕНТОВСВЕТОИНДУЦИРУЕМОЙ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИСпециальность 01.04.21 – лазерная физикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукМосква – 2007Работа выполнена на кафедре общей физики и волновых процессов физическогофакультета Московского государственного университета им. М.В.
ЛомоносоваНаучный руководитель:доктор физико-математических наукЧикишев Андрей ЮрьевичОфициальные оппоненты:доктор физико-математических наукпрофессор Фадеев Виктор Владимировичкандидат химических наукПравдин Александр БорисовичВедущая организация:Научно-исследовательский институт лазерных исследований химическогофакультета Санкт-Петербургского государственного университетаЗащитасостоится18октября2007годав16часовназаседаниидиссертационного совета Д 501.001.31 при МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу:Россия, 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, МГУ, Корпус нелинейнойоптики, аудитория С.А.Ахманова.С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультетаМГУ им.
М.В. Ломоносова.Автореферат разослан «_» сентября 2007 годаУченый секретарь диссертационного совета Д 501.001.31кандидат физико-математических наук, доцентИльинова Т.М.2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы диссертацииЗнания о строении ферментов, их динамических свойствах, фермент-субстратныхвзаимодействиях и других аспектах молекулярных механизмов функционированияферментативных систем чрезвычайно актуальны. Лазерная спектроскопия, в частностилазерная спектроскопия комбинационного рассеяния (КР), является одним из наиболееинформативных методов изучения конформационного состояния биомолекул.Важное место в современных исследованиях белков занимает разработка иприменение кинетических методов, позволяющих изучать динамику функционированияферментативных систем в реальном времени и с высоким разрешением. Основнымподходами на сегодняшний день являются методы остановленного потока (stopped-flow),постоянного потока (constant-flow), метод гашения реакции (quenched-flow) и методафотоуправления (метод вспышки, flash method).
Разработанный в начале 1950-х методвспышкиявляется,пожалуй,наиболееэффективнымспособомуправленияферментативной реакцией. В то же время ферментативная активность большинствабелков-ферментов не поддаётся фотоуправлению напрямую. В начале 1970-х былпредложен метод управления активностью фермента с помощью фоточувствительногосубстрата-регулятора, однако процесс фотоуправления субстратом, его промежуточныесостояния и эффективность преобразования субстрата-регулятора в необходимую формудо сих пор практически не исследованы.
Поэтому одной из важнейших и актуальныхзадач является разработка метода лазерной подготовки субстрата-регулятора дляреализации светоиндуцируемой ферментативной реакции.Обработка КР спектров многих веществ, особенно биомолекул, осложняетсяналичием в них широкополосного фона. Интенсивность фона, как правило, на несколькопорядков превосходит интенсивность КР линий исследуемого вещества.
Несмотря на то,что эта проблема возникла в первых работах по КР спектроскопии, а ежегодно этомуметоду посвящается большое число работ, до сих пор единой точки зрения на природуэтого явления не существует. В первую очередь, это связано с тем, что большинствоисследователей воспринимает широкополосный фон лишь как помеху для полученияинформации о колебательных резонансах. В настоящее время известно несколькоспособовуменьшения интенсивности широкополосного фона3посравнениюсинтенсивностью КР линий: перегонка, замораживание, использование лазерныхисточниковвближнейинфракраснойобласти.Широкоприменяетсяспособфотообесцвечивания («выжигания») образца, основанный на уменьшении интенсивностиширокополосного фона во времени при облучении образца лазерным излучением.Существование эффекта фотообесцвечивания растворов белков изначально объяснялосьразрушением примесей-флуорофоров, поскольку сами молекулы белка не поглощаютизлучение видимого диапазона.
В последнее время появились экспериментальныеданные,позволяющиеутверждать,чтоширокополосныйфонопределяетсяфлуоресценцией самих биологических молекул, а не примесей. В этом случае наличиеэффекта фотообесцвечивания может говорить о деструктивном характере воздействияизлучения на биомолекулы.
Таким образом, исследование фотообесцвечивания растворовбиомолекул является актуальным и может раскрыть новые аспекты взаимодействиялазерного излучения с биомолекулами.Известно, что в функционировании ферментов существенную роль могут игратьнизкочастотные (НЧ) колебания белковой молекулы. При этом КР спектры в НЧ областисущественно различаются для одного и того же белка в твердом состоянии и в водномрастворе, кроме того, в водных растворах наблюдение НЧ колебаний затруднено.Отсутствие ярко выраженных НЧ комбинационных резонансов в водных растворахбелковбольшинствоисследователейсвязываетсвозможнымдемпфированиемсоответствующих колебаний водным окружением.
Таким образом, вопрос о влияниирастворителей на НЧ колебания является весьма актуальным. Исследование влияниярастворителей на НЧ колебания целесообразно проводить на примере простыхорганических молекул и дополнять экспериментальные результаты сравнительнонесложным теоретическим анализом.Цели и задачиЦелью настоящей работы является совершенствование методов изучениястроенияидинамическихвзаимодействийссвойствиспользованиемферментов,лазернойферментативной реакции.4атакжеспектроскопиифермент-субстратныхсветоиндуцируемойВ диссертационной работе решаются следующие задачи:1.Установление зависимости параметров широкополосного фона от молекулярноймассы и структуры биополимеров.2.Выявлениевозможныхпричиннемонотонногоповеденияинтенсивностиширокополосного фона во времени при облучении видимым лазерным излучениемрастворов белков.3.Определение возможных изменений параметров низкочастотных колебательныхрезонансов белков под влиянием растворителей.4.Определение оптимальной длины волны лазерного излучения и оптимальной дозыоблучениядляэффективнойлазернойактивациисубстрата-регуляторасветоиндуцируемой ферментативной реакции.Научная новизна1.Показано, что параметры широкополосного фона в КР спектрах растворовбиомолекул зависят как от молекулярной массы, так и от конформационногосостояния биомолекул.2.С использованием спектроскопии оптического эффекта Керра, индуцированногокомбинационным резонансом, получены спектры водного раствора белка вдиапазоне от -4 до 4 см-1.3.Методом КР спектроскопии, показано, что влияние растворителя на низкочастотныеколебательные резонансы растворенного вещества выражается в сдвиге, уширении иизменении формы линии.
Наблюдаемые изменения не могут быть объяснены толькоизменением эффективного трения в присутствии молекул растворителя.4.Охарактеризован метод подготовки (с использованием лазерного излучения)светочувствительного субстрата-регулятора для реализации светоиндуцируемойферментативной реакцииПрактическая ценностьИспользованиесветочувствительногосубстрата-регулятора,полученногоспомощью охарактеризованного метода лазерной подготовки, позволяет реализовать5светоиндуцируемую ферментативную реакцию, запускаемую импульсом лазерногоизлучения.Этодаетвозможностьисследоватьдинамическиехарактеристикиконформационного состояния фермента в реальном времени и получать уникальнуюинформацию о связи структуры и функции ферментов.Основные положения, выносимые на защиту:1.При отсутствии флуоресцирующих примесей и флуоресценции растворителянаблюдаемая интенсивность широкополосного фона в КР спектрах водныхрастворовбелковихарактерноевремяфотообесцвечиваниязависятотконформационного состояния белка.2.При анализе низкочастотных колебательных спектров белковых молекул в растворевлияние растворителя не может быть сведено к увеличению эффективного трения идолжно исследоваться с учетом изменения частот и относительных интенсивностейлиний колебательного спектра.3.Предложенная лазерно-оптическая процедура позволяет эффективно нарабатыватьнеобходимую форму субстрата-регулятора светоиндуцируемой ферментативнойреакции (до 55% от исходного вещества, при длине волны лазерного излучении325 нм и дозе облучения 6 МДж/моль), а также характеризовать и контролироватьсостав реакционной смеси.Апробация работы.По результатам диссертационной работы опубликовано 9 научных статей, из них 2в журналах из списка ВАК России, и 10 тезисов докладов.Результаты диссертационной работы докладывались на 9 международныхконференциях: Austral-Asian Biospectroscopy Conference (Карат, Таиланд, 2003), ItalianRussian Laser Symposium ITARUS (Москва, Россия, 2003), Международная научнаяконференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2003» (Москва,Россия, 2003), International Workshop on Noise in Condensed Matter and Complex Systems(Палермо, Италия, 2004), International Conference on Coherent and Nonlinear Optics ICONO(Санкт-Петербург, Россия, 2005), European Congress on Molecular Spectroscopy (Стамбул,Турция, 2006), Workshop on Biophotonics and Molecular Simulations (Братислава, Словакия,62006), International Conference on Coherent and Nonlinear Optics ICONO (Минск, Беларусь,2007), International Conference on Laser Applications in Life Sciences LALS (Москва,Россия, 2007).Структура и объем диссертацииДиссертация состоит из введения, пяти глав и заключения.
Работа изложена на113 страницах, включает 52 рисунка, 5 таблиц и список литературы из 112 наименований.Личный вклад автораВсе исследования методом лазерной КР спектроскопии, а также отработка ихарактеризацияметодалазерногоуправлениясубстратом-регуляторомсветоиндуцируемой ферментативной реакции проведены автором лично. Результатыисследований, проведенных методом спектроскопии оптического эффекта Керра,индуцированного комбинационным резонансом, получены при определяющем вкладеавтора в совместной работе. Результаты исследований методом ЯМР получены приличном участии автора в совместной работе.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
