Количественный анализ структуры частично кристаллических полимеров и композитов на их основе по данным атомно-силовой микроскопии (1103417), страница 4
Текст из файла (страница 4)
На примере бычьего сывороточногоальбумина (БСА) были получены изображения отдельных молекул, былотработан протокол приготовления образцов и подобраны параметрысканирования, которые затем использовались для получения изображенийбелков паутины.В работе сопоставляются два типа надмолекулярных агрегатов:нанофибриллы и поверхностные ламели. Они принципиально отличаются тем,что первые существуют в растворе, а вторые формируются из отдельныхмолекул при их адсорбции на подложку. Хотя нанофибриллы белка паутиныбыли описаны ранее [4], однако способ укладки молекул в них до настоящеговремени не ясен. В данной работе для нанофибрилл получена оценкаагрегационного числа: оно составляет α=8-10 молекул на 100 нм длины.Рисунок 9 – Нанофибриллы 1F9 (А) и 2Е12 (Б) на слюде. Белки былирастворены в дистиллированной воде. Стрелками показаны пересечениянанофибрилл.Изображение нанофибрилл приведено на рисунке 9.
Важно, чтонаблюдаемые нанофибриллы формируются в растворе, а не собираются изболее мелких структурных единиц при адсорбции на подложку. Дляобоснования этого утверждения приводятся следующие аргументы. Во-первых,17нанофибриллы имеют закрутку вокруг собственной оси, в то время какзакрутка растущего на поверхности агрегата потребовала бы его частичнойдесорбции, что крайне маловероятно.
Во-вторых, были получены изображениянанофибрилл на различных подложках: на слюде и на аморфном углероде,гидрофилизованном в тлеющем разряде. Хотя шероховатость подложки изаморфного углерода мешает точному измерению размеров нанофибрилл,можно утверждать, что наблюдаемые на разных подложках нанофибриллыморфологически сходны.
Таким образом, возможность наблюдениянанофибрилл при помощи АСМ не зависит от использования конкретнойподложки – это косвенно подтверждает существование нанофибрилл врастворе. В-третьих, нанофибриллы образуют пересечения и самопересечения(они указаны стрелками на рисунке 9 А), что также указывает насуществование нанофибрилл в растворе.Рисунок 10 – АСМ-изображения белка 1F9, нанесенного на слюду из раствора сконцентрацией ~20 мкг/мл в течение t=1,5 мин. Внизу показаны графикисечений вдоль линий 1 и 2 на изображении А.Если растворить белок паутины в денатурирующем растворителе(использовались два растворителя – 6М GdmSCN и 10% раствор NaCl в 90%HCOOH), а затем нанести на слюду, то наблюдаются нитевидные структуры,которые радикально отличаются от нанофибрилл. Эти структуры былиинтерпретированы как ламели двух типов (монослойные и двухслойные): они18представлены на рисунках 10 для белка 1F9 и 11 для белка 2Е12.
Морфология иразмеры наблюдаемых структур не зависят от конкретного использованногорастворителя.Ламели первого типа (монослойные) имеют высоту над подложкой0,55±0,15 нм для 1F9, 0,70±0,15 нм для 2Е12 – это близко к толщине β-листа,уложенного на слюду (0,6 нм [5], 0,6±0,2 нм [6]). Они показаны на рисунках10 А и 11 А звездочкой (*). На них формируются более высокие ламели второготипа: они показаны на рисунках 10 А и 11 А двумя звездочками (**) и имеютвысоту в 3-4 раза больше высоты монослойных ламелей.Количество осажденного на подложку вещества можно варьировать,меняя концентрацию раствора и время экспозиции капли на слюде.
Приконцентрации белка в растворе 5-10 мкг/мл (50-100 нМ) и экспозиции наподложке 1-2 минуты выявляются ламели только первого типа. Приповышении концентрации до ~20 мкг/мл (~200 нМ) или увеличении экспозициикапли на подложке с 2 до 4-5 минут, поверх ламелей начинает формироватьсявторой адсорбированный слой в виде ламелей второго типа (рисунки 10,11).Ламели второго типа ориентированы по монослойным (рисунки 10 Б, 11 Б): наАСМ-изображениях видно, что продолжением каждой ламели второго типаявляется более тонкая монослойная ламель.Рисунок 11 – АСМ-изображения белка 2Е12, нанесенного на слюду из растворас концентрацией ~20 мкг/мл в течение t=1,5 мин.
Внизу показаны графикисечений вдоль линий на кадрах А и Б. На кадре Б для улучшения контрастностивыбрана инвертированная цветовая шкала, отличающаяся от традиционной.19Для интерпретации полученных данных была предложена схемарастворения и агрегации белков паутины, которая представлена на рисунке 12.В основе этой схемы лежит утверждение о том, что белки паутины могутсуществовать в водных растворах в виде нанофибрилл и в виде отдельныхмолекул. Если растворить сухой белок в дистиллированной воде, то мыполучаем раствор, в котором белок преимущественно находится в состояниинанофибрилл.
Если же обработать сухой белок растворителями и потомперевести в воду (разбавлением или гель-фильтрацией), то мы получаемраствор, в котором белок преимущественно находится в состоянии отдельныхмолекул (по-видимому, они имеют конформацию клубков). При длительномхранении или интенсивном механическом перемешивании он переходит всостояние нанофибрилл.Рисунок 12 – Схема растворения и адсорбции белков паутины. Размеры АСМизображений, приведенных внизу: слева 3х3 мкм, справа 800х800 нм.20Обсудим конформацию молекул, входящих в состав ламелей.
Посколькуламели имеют постоянную ширину (для ламелей 2Е12 она составляет 8±1 нм,для 1F9 она имеет близкое значение, однако определить его не удалось) ималую высоту, для описания конформации молекул в них можно использоватьмодель плоского зигзага. В этой модели предполагается, что молекулараспластана по подложке и стабилизирована водородными связями, как вантипараллельном β-листе [5].Когда молекула белка приходит в контакт со слюдой, она либостановится зародышем новой ламели, либо продолжает рост ужесуществующей, т.е. ламели формируются путем последовательногоприсоединения молекул из раствора. Если же молекула адсорбируется наповерхность уже сформированной ламели, то она не распластывается домонослоя, а сворачивается в «трехмерную» структуру – об этом говоритразличие высот ламелей первого и второго типа.
Это подтверждается такжетем, что ламели второго типа имеют сегментированную структуру. Как видноиз сечений, проведенных вдоль ламелей второго типа на рисунках 10 и 11,вдоль гребня двухслойной ламели наблюдаются выступы и впадины спериодом l1F9=14±5 нм и l2E12=21±6 нм, т.е. ламели второго типа являютсясегментированными. Объем отдельного сегмента хорошо соответствует объемуодной или двух близко расположенных молекул белка.Отметим ряд фактов, которые подтверждают схему, предложенную нарисунке 12. Во-первых, возможность формирования ламелей зависит отподложки – они возникают на слюде и не возникают на графите.
При нанесениина графит белок 1F9 не образует ламелей, а адсорбируется в виденеструктурированных комков, в контрольном эксперименте (без белка, толькорастворитель) графитовая подложка оказывается чистой. Во-вторых, у ламелей,в отличие от нанофибрилл, отсутствуют пересечения и самопересечения судвоением высоты. В-третьих, методом флуоресцентной корреляционнойспектроскопии было показано, что белок 1F9 после растворения в 6M GdmSCNоказывается в воде в виде отдельных молекул [7]. Это было показано вэксперименте с белком 1F9, меченым родамином, путем измерениякоэффициента диффузии метки.
Четвертый аргумент основан на данныхкругового дихроизма [4,7]. Для нанофибрилл белков паутины характерновысокое содержание β-листов. Белки 1F9 и 2Е12 после обработки вденатурирующих растворителях преимущественно имеют вторичнуюструктуру спирали полипролин-II (PP-II), типичную для денатурированныхбелков [8]. Данные кругового дихроизма хорошо согласуются с тезисом о том,что после денатурации 1F9 или 2Е12 и уменьшения концентрации хаотропногоагента существенная доля белка не сразу агрегирует в нанофибриллы, а21остается в состоянии отдельных молекул. В-пятых, для 2Е12 удалось получитьмикроскопические изображения отдельных молекул.Рисунок 13 – АСМ-изображения ламелей белков 1F9 (А) и 2Е12 (Б) на слюде.Образцы приготовлены в идентичных условиях из растворов с концентрациейс=5 мкг/мл.При идентичных условиях нанесения на подложку длина монослойныхламелей белка 1F9 существенно больше, чем длина ламелей белка 2Е12(Рисунок 13).
В частности, на примере белка 2Е12 удалось получитьизображения мономолекулярных ламелей, т.е. отдельных молекул, уложенныхна подложке в конформации плоского зигзага. Наблюдаемая разница в длинеламелей может быть объяснена, исходя из данных о кинетике формированиявторичных структур в белках [9]. Когда молекула белка паутины, находящаясяв водном растворе, приходит в контакт со слюдой, она под действиемповерхностных сил сворачивается в плоский зигзаг.
Этот процесс оказываетсяэнергетически выгодным, по-видимому, не только из-за взаимодействия сподложкой, но и из-за образования водородных связей между соседнимифрагментами цепи, как в β-листе. Скорость роста β-листов ограниченаскоростью их зарождения, которая, в свою очередь, зависит от вероятностиобразования петли. Поскольку в белке 2Е12 присутствуют остатки пролина, тоони снижают энергетический порог образования петли и зародыша ламели,поэтому зародышеобразование ламелей белка 2Е12 происходит быстрее, чемзародышеобразование ламелей белка 1F9. Это, в свою очередь, приводит ктому, что ламели 1F9 оказываются длиннее ламелей белка 2Е12.В заключительной части главы описаны эксперименты по нанесению наподложку глобулярного белка, обработанного денатурирующим растворителем.Показано, что белок БСА после растворения в 10% растворе NaCl в 90%22HCOOH, последующего разведения водой и нанесения на слюду не формируетламелей (в отличие от 1F9 и 2Е12), а адсорбируется в форме глобул.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
