Диссертация (1103411), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Оценка пространственного разрешения около0.7мкм(рис.3.4.6.б).Такимобразом,былополученопространственноераспределение плотности оптических фононов на основе когерентного антистоксова- 113 рассеяния света в экспериментах с пленкой синтетического алмаза сформированнойметодом газофазного осаждения, обладающей субмикронными дефектами структуры,КАРС сигнал, отн. ед.вызванными температурной нестабильностью в процессе синтеза алмазной пленки.2m0,900,750,6002468101214Положение, мкм(а)(б)Рис.3.4.6.
(а) Карта КАРС-сигнала, снятая с поверхности искусственнойалмазной пленки и (б) одномерный профиль сигнала КАРС при сканировании фокусавдоль поверхности.В нашей работе мы показали, что техника фемтосекундной КАРС-спектроскопиипозволяет измерять амплитуду, время дефазировки и параметры оптическойнелинейности оптических фононов в синтетических алмазных пленках. Измеренияпроводилисьсфемтосекундногоиспользованиемгенераторананеусиленныхимпульсов,кристаллеCr:forsterite,получаемыхаотисточникомперестраиваемого излучения служил МС световод.
Для формирования спектральновременных параметров импульсов накачки, участвующих в процессе генерациинелинейного когерентного сигнала на антистоксовой частоте, был предложен методудвоения оптической частоты лазерных импульсов в кристаллах ниобата лития спериодической доменной структурой и протяженных кристаллах трибората лития, атакже метод спектральной компрессии импульсов в МС световоде. С использованиемтехники КАРС-микроспектроскопии с импульсами накачки, имеющими специальныепрофилиогибающейинтенсивности,мыпродемонстрировалитрехмернуювизуализацию колебаний когерентных оптических фононов в алмазных пленках свысоким пространственным разрешением.- 114 §3.5 КАРС-микроскопия тканей головного мозга с волоконным источникомперестраиваемых фемтосекундных импульсовНелинейно-оптические методы открывают новые возможности для исследованияфункциональных особенностей и построения изображения со сверхвысокимпространственнымразрешениембиологическихтканей,недостижимымдлястандартных оптических микроскопов.
Двухфотонная микроскопия, микроскопиясверхвысокого разрешения (STED), микроскопия когерентного комбинационногорассеяния – это неполный перечень методов, получивших широкое применение вбиологии и медицине [8,184]. Основные преимущества техники КАРС-микроскопиикак метода биомедицинской диагностики обусловлены высоким пространственнымразрешением,обеспечиваемымнелинейнойприродойпроцесса,высокойчувствительность, связанной с когерентным характером явления, а также высокойселективностью в условиях точной настройки световых полей в резонанс скомбинационно активнымимодамиисследуемыхмолекул.Благодаряэтомууникальному сочетанию новых возможностей и преимуществ техника КАРСмикроскопии находит все более широкое применение в биомедицинской оптике,включаярешениезадачвизуализациидеталейпространственнойструктурыбиотканей и исследования процессов внутри живых клеток [37,38].Исследование строения сети нейронов головного мозга и их функциональныхсвязей является одной из самых интригующих и глобальных задач современнойнауки, требующей междисциплинарных усилий по ее решению.
Как и почти любаябиологическая ткань, мозг содержит большое количество липидов, которые играютважнейшую роль в функционировании нейронов, и их можно поделить на различныефункциональныеклассы,такиекакфосфолипиды,сфинголипиды,гликосфинголипиды и холестерин. Липиды выполняют самые разнообразныефункции - снабжают энергией клеточные процессы, формируют клеточныемембраны, участвуют в межклеточной и внутриклеточной сигнализации. Например,холестерин, фосфолипиды и галактолипиды являются основой для создания миелина,органического вещества, покрывающего аксоны и обеспечивающего проводимостьнервныхимпульсов.Изменениесоставалипидовприводиткразличным- 115 паталогическим изменениям, таким как образование раковых опухолей, склероза,болезни Альцгеймера [71,73,76].Особенность химического строения липидов в том, что их молекулы содержатдлинные цепи углеводородов, формируя большое количество функциональных группCH2 и СН3.
Симметричные и антисимметричные деформационные моды колебанийкоторых имеют частоты в диапазоне от 2800 см-1 до 3100 см-1. Сечение рамановскогорассеяния света на колебаниях весьма велико, что вместе с большим количествомтаких связей во всей молекуле делает метод когерентного антистоксова рассеяниясвета, зависящие от количества излучающих молекул как ~N2, очень эффективныминструментом для безмаркерной визуализации тканей головного мозга, в частностираспределения липидов [37].
При реализации КАРС-микроспектроскопии дляисследования физиологии и патологии тканей мозга лазерная система обычнонастраивается на (комбинационную) рамановскую линию с частотой отстройки 2850см-1, котораясоответствует симметричным колебанияматомов водородавфункциональной группе СН2 в молекулах липидов мембраны клетки и миелина[73,94].В наших исследованиях мы демонстрируем функциональность реализованногоКАРС-микроскопа для построения изображений срезов головного мозга мыши ираспределения липидов в них. В качестве образцов были использованы срезыголовного мозга лабораторноймыши (толщинасрезов 50 мкм). Образцыпредоставлялись нашими коллегами из группы профессора К.В.Анохина (НИИНормальной Физиологии имени П.К.Анохина).Эксперименты проводились на лазерной системе, включающей задающийгенератор сверхкоротких импульсов и микроструктурированное волокно дляформированияперестраиваемогочувствительностииспользованиеприизлучениясканированиимодификации(рис.3.5.1).биологическихКАРС-спектрометрасТребованиетканейвысокойобуславливаетнелинейно-оптическимикристаллами для удвоения частоты.
Подробное описание экспериментальнойустановки для генерации излучения с необходимыми параметрами приведено впараграфе 3.3. Главное отличие модификации системы для зондирования достаточношироких рамановских линий органических молекул от варианта, описанного в- 116 параграфе 3.4 и использованного для исследования долгоживущих оптическихфононов, заключается в приготовлении узкополосных субпикосекундных импульсовнакачки при удвоении частоты в кристаллах PPLN и LBO длиной 20 мм.Рис.3.5.1. Схема экспериментальной установки по КАРС-микроскопиибиологических тканей (подробное описание системы приведено в параграфе 3.3)Вставка вверху: поперечное сечение МС световода; вставка внизу: типичнаяобласти перестройки ИК излучения в МС световоде.Волнойнакачкислужилипочтиспектрально-ограниченныеимпульсыдлительностью 330 фс на длине волны 623 нм с энергией 1.5 нДж, спектральнаяширина этих импульсов после спектральной компрессии в процессе удвоения частотыв кристалле PPLN составляла величину около 50 см-1.
Стоксов импульс на длиневолны 750 нм с длительностью 380 фс с энергией до 0.5 нДж генерировался начастоте второй гармоники от сформированного в МС-волокне импульса солитона. Впроцессе удвоения частоты в кристалле LBO длиной 20 мм также имела местоспектральная компрессия, и спектральная ширина стоксова импульса не превышала40 см-1. Разность частот импульсов накачки была около 2850 см-1 и попадала вобласть симметричных колебаний СН2-группы.
Характерное время дефазировкиколебаний таких связей в живых тканях достаточно мало и составляет 0.3-0.5 пс, а- 117 ширина линии около 45 см-1 [243], и методика временного отделения нерезонансногофона от резонансного сигнала работают плохо. Поэтому мы пошли по традиционномупути повышения эффективности КАРС-спектроскопии - старались согласоватьширины спектров импульсов накачки с шириной интересующей линии рамановскогоперехода. В исследованиях мы не затрагивали вопрос сложного строения полосы всехмод колебания СНx-групп и выделения вкладов каждой.(а)(б)(в)(г)(д)Рис.3.5.2. Изображения срезов головного мозга мыши, полученные методомКАРС-микроспектросокпии. Желудочек (а), соматосенсорная кора (б), панорамноеизображение соматосенсорной коры (в), область гиппокампа (г, д).- 118 Возбуждающие импульсы сводились на дихроичном зеркале и фокусировались вобразец с помощью микроскопного объектива ЛОМО x20 NA=0.4.
Нелинейныйсигнал на длине волны 525 нм выделялся по спектру при помощи оптическихфильтров высокой частоты, полосовых фильтров со спектральной ширинойпропускания40нмирегистрировалсянаФЭУ.Образецпомещалсянамоторизированную микрометрическую подачку, осуществляющую сканирование втрех перпендикулярных направлениях (XYZ) и синхронизованную с системойдетектирования на базе синхронного усилителя SR830, что в результате обеспечилореализацию сканирующее нелинейно-оптической микроскопии. Временная константав синхронном усилителе была установлена 100 мс на одну точку. На сканированиеобласти 100х100 мкм2 с шагом 1 мкм требовалось около 40 минут.
Невысокая средняяи пиковая мощности импульсов накачки позволяют говорить о невозмущающемхарактере измерений живых тканей [35].Нарисунке3.5.2представленыизображениясрезовголовногомозгалабораторной мыши, полученные методом КАРС-микроспектроскопии. В частности,представленыизображенияжелудочка(рис.3.5.2.а)инебольшойобластисоматосенсорной коры головного мозга (рис.3.5.2.б, запись проводилась с меньшимшагом по пространству). Желудочек находится в центре изображения на рис.
3.5.2.а иокружен слоем пирамидальных нейронов, “представленных” темной областью.Пространство между клетками заполнено веществом, состоящим из межклеточнойжидкости, миелина и отростков нейронов – аксонов и дендритов. Миелин, состоящийиз большого количества билипидных слоев, является источником интенсивногонелинейно-оптического сигнала на антистоксовой частоте [244]. Внутреннее строениенейрона таково, что внутри клетки почти нет веществ с высокой концентрациейсвязей СН (за исключением липидных тел субмикронного размера), что неспособствует генерации КАРС-сигнала.
По изображению из соматосенсорной коры(рис.3.5.2.б и 3.5.2.в) можно установить характер неоднородного распределениябелого вещества в данной области мозга и наличие областей повышеннойконцентрации миелина. Со стандартным оптическим микроскопом подобнуюинформацию получить практически невозможно из-за слабых различий линейныхоптических свойств данных веществ. На панорамном изображении (рис.3.5.2.в) слеваприсутствует область слабого КАРС-сигнала, соответствующая соматосенсорной- 119 коре, а справа - область высокого сигнала, которая относится к области corpuscallosum. В этой области множество аксонов от расположенных в коре нейроновобразуют своеобразный “жгут”, тянущийся до центральных областей мозга. Высокаяплотность аксонов обуславливает наличие большого количества миелина, которыйхорошовизуализируетсяметодикойКАРС[244].Сдругойстороны,всоматосенсорной коре плотность аксонов и концентрация миелина заметно ниже, чтоотражается в снижении среднего уровня интенсивности изображения (рис.3.5.2.в).Инверсная контрастность полученных карт позволяет определить размеры нейронов вразличных областях головного мозга.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
