Автореферат (1102289), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Это, в свою очередь, свидетельствует о значимости результатовАСМ-исследований агрегатов σ70-субъединицы, полученных в воздушнойсреде.Третья глава посвящена описанию червеобразной агрегации σ70субъединицы РНК-полимеразы E. coli. При исследовании образцов σ70субъединицы на АСМ-изображениях помимо палочкообразных агрегатов16наблюдались червеобразные агрегаты, имеющие структуру “бусин на нити”(Рисунок 9).
Похожие агрегаты белка упоминались и ранее, однако, безасбРисунок 9. АСМ-изображения червеобразных агрегатов σ70-субъединицы, имеющихструктуру “бусин на нити” (а) в жидкости, (б) на воздухе, (с) одновременное наблюдениеразных структур на воздухе.описания морфологии и возможной роли в контексте амилоидной агрегации.Червеобразные агрегаты наблюдались в широком диапазоне концентрацийсолей: от 0 до 200 мМ NaCl, 50 мМ MgSO4. По форме такие агрегатынапоминают “бусины на нити” с высотой бусин hb 2,9 ± 0,5 нм и 4,2 ± 0,6 нм,полученной при АСМ-сканировании на воздухе и в жидкости, соответственно,а также расстоянием между ними lb 15-20 нм. Значение высоты “бусины”превышает размер σ70-субъединицы (1,8 ± 0,3 нм).
Поэтому, вероятнее всего,бусины образованы более чем одной молекулой белка.Для оценки жесткости или упругости обнаруженных червеобразныхагрегатов наиболее подходящей величиной является персистентная длина P.Для расчета P использовалась модель червеобразной цепи, требующей гауссовараспределения угла θ между касательными к контуру молекулы, проведённымив точках, разделённых расстоянием l вдоль этого контура:(())2 = ( 0,5 (−2 ⁄2)) 2(1)17〈 2 ()〉 = ⁄(2)Последняя формула позволяет рассчитать персистентную длину из〈 2 ()〉 = ().
Величина персистентнойлинейной регрессии зависимостидлины оказалась в диапазоне 15-25 нм (таблица 1).Модуль Юнга Y связан с персистентной длиной P соотношением: = ⁄,(3)где kB – константа Больцмана, T – абсолютная температура, а I – моментинерции площади сечения фибриллы.Для расчета модуля Юнга червеобразных структур из уравнения (3) был оцененмомент инерции площади сечения I.
В первом приближении цилиндрическойформы, считая поперечное сечение круглым с радиусом r, расчет проведен поформуле = 2 ⁄4 , где радиус взят как половина высоты “бусины” (hb/2). Втаблице 1 представлены значения персистентной длины P и модуля Юнга Y,рассчитанных в этом приближении. Рассчитанный в первом приближениимодуль Юнга червеобразных структур σ70-субъединицы оказался в пределах 4,1– 6,5 МПа, что говорит о высокой гибкости этих агрегатов, вУсловияP, нмY, МПаВ отсутствие солей, на воздухе24,5 ± 1,86,5 ± 0,820 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4, на воздухе22,6 ± 1,16,0 ± 0,720 мМ NaCl, 20 мМ MgSO4, на воздухе19,1 ± 0,45,1 ± 0,620 мМ NaCl, 30 мМ MgSO4, на воздухе16,7 ± 0,44,5 ± 0,520 мМ NaCl, 50 мМ MgSO4, на воздухе15,5 ± 0,44,1 ± 0,520 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4, в жидкости16,9 ± 0,54,5 ± 0,5Таблица 1.
Персистентная длина P и модуль Юнга Y червеобразных структур σ70субъединицы в различных растворах солей.18противоположность зрелым амилоидным фибриллам, для которых эта величиналежит в диапазоне 2-14 ГПа. Более того, рассчитанная величина оказаласьсущественно меньше известного из литературы модуля Юнга подобныхчервеобразных протофибрилл, образуемых другими белками, например,овальбумином (1,1 ГПа), α-лактоглобулином (140 МПа), или N-терминальнымдоменом фактора созревания гидрогеназыE. coli HypF-N (60 МПа). Такиенизкие значения модуля Юнга для протофибрилл σ70-субъединицы говорят оналичии более слабых межмолекулярных взаимодействий, чем у зрелыхамилоидных фибрилл, и отсутствии типичной для амилоидов высокойструктурной организации β-структур.В четвертой главе описана иерархическая модель “кофейных чашек”агрегации σ70-субъединицы. Процесс созревания зрелых амилоидных фибриллвключает разные стадии, при этом в различных исследованиях червеобразныеструктуры предполагаются как промежуточным звеном процесса, так иальтернативным исходом нарушения фолдинга белков.Основываясьнаполученныхданных,былапредложенамодель“кофейных чашек”, способная объяснить полученные результаты.
Даннаямодель подразумевает наличие внутри белка двух “самокомплементарных”участков,обеспечивающихкомплементарностьможетсамосборкубытьбелка.Впредставленаслучаебелковспецифическимпространственным расположением аминокислотных остатков (амилоидогенныхучастков) и реализована посредством электростатики, водородных связей игидрофобныхвзаимодействий.Белки,какправило,имеютсложнуюпространственную структуру, и для их взаимодействия требуется частичнаяденатурация и раскрытие амилоидогенных участков. Хорошо известно, чтобольшинство амилоидогенных белков не структурированы, или содержатнеструктурированные участки.
Частичная делеция участка 1.1 в N-концевомдомене (мутанты D1 и D4), по-видимому, приводит к дополнительномуразворачиванию мономера белка и обеспечивает более выгодные стерические19условия для агрегации. Повышение способности к образованию фибрилл вслучае мутантов D1 и D4 также может быть объяснено обнажением некоторыхамилоидогенных участков, которые обычно спрятаны и экранированы в σ70субъединице дикого типа. Ярко выраженный эффект возрастания числапалочкообразных агрегатов для мутанта D1 показывает, что удаленный участок(1-73) может функционировать как локальный шаперон, защищающий белок отинтенсивной агрегации.Предлагаемая модель представлена на рисунке 14.
Амилоидогенныймономерлинейныеразветвленныенуклеациячервеобразные агрегатыамилоидРисунок 14. Модель “кофейных чашек” амилоидной агрегации белков.белок представлен в виде “кофейной чашки”, в котором “ручка” и “чаша”соответствуют частично разупорядоченному участку и структурированнойглобуле, соответственно. Первый этап сборки – образование димера.Следующий шаг агрегации включает добавление частично (или полностью)разупорядоченных мономеров.
Модель не исключает присоединение болеесложныхблоков(как,например,стабильныхдимеров)впроцессе20полимеризации. Вследствие гибкости разупорядоченных “ручек” и вращения“чаш” растущий полимер проявляет червеобразную морфологию (рисунок 14,A). Однако при достижении определенной длины (специфической для каждогоотдельного белка), олигомер замыкается в псевдо-цикл (рисунок 14, B). Такоезамыкание можно рассматривать как “ядро” для запуска роста амилоидныхфибрилл по спиральному типу. Если же длина олигомера превысит некоторыйкритический размер, то в таком случае агрегация пойдет по пути образованиячервеобразных “бусин на нити”.Предложеннаяисследованиимодельфибриллобъясняетявления.Вразличныечастности,наблюдаемыеразличиеприморфологиичервеобразных и фибриллярных агрегатов одного и того же белка заключаетсяв вариациях раскрытия “самокомплементарных участков” в зависимости отокружающих условий.
Более того, модель допускает разветвление олигомеров собразованием вторичных сайтов нуклеации, а также формирование закрытыхколец. Значительная вариация диаметра “бусин” внутри одного образцачервеобразной структуры σ70-субъединицы означает наличие сайтов ветвления.В то же время, согласно данным АСМ, белок способен спонтанносамоорганизовываться в спиральные палочкообразные агрегаты c размеромвитка ~ 20 нм и одинаковой высотой.РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ1) Впервые показана способность σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coli кспонтанномуобразованиюамилоидоподобныхагрегатовinvitro.Продемонстрирована фибриллярная форма агрегатов диаметром 5,4 ± 0,2нм, длиной до 300 нм и левозакрученной спиральностью с шагом витка ~ 20нм.2) Показана сложная зависимость интенсивности палочкообразной агрегацииот ионной силы: возрастание в диапазоне концентрации NaCl 0-40 мM идальнейший спад в диапазоне 40-200 мM NaCl.213) Определеныбиотехнологическиважныеаспектыагрегацииσ70-субъединицы, такие как использование частично лишённых N-концамутантныхвариантовбелкаПродемонстрирована рольиопределённогоионногосостава.N-концевого домена белка какфактора,препятствующего интенсивной агрегации белка.4) Определённые из АСМ-изображений значения модуля Юнга червеобразныхагрегатов σ70-субъединицы (4,1 – 6,5 МПа) говорят в пользу ихнеамилоидной природы.5) Обнаруженполиморфизмагрегатовбелкаσ70-субъединицы:палочкообразных амилоидных фибрилл и червеобразных неамилоидных“бусин на нити”.
Построена модель “кофейных чашек”, объясняющаяполиморфизм и пути формирования того или иного типа наблюдаемыхагрегатов белка.ПУБЛИКАЦИИ В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ НАУЧНЫХ ИЗДАНИЯХ,ИНДЕКСИРУЕМЫХ В БАЗАХ ДАННЫХ WEB OF SCIENCE, SCOPUS, RSCI:1. E.V. Dubrovin, O.N. Koroleva, Yu.A. Khodak, N.V. Kuzmina, I.V.Yaminsky, V.L. Drutsa. AFM study of Escherichia coli RNA polymerase σ70subunit aggregation // Nanomedicine: Nanotechnology,Biology andMedicine, - 2012, - Vol.
8, - P. 54-62.2. O.N. Koroleva, E.V. Dubrovin, Yu.A. Khodak, N.V. Kuzmina, I.V.Yaminsky. The model of amyloid aggregation of Escherichia coli RNApolymerase σ70 subunit based on AFM data in vitro assays // Cell Biochemistryand Biophysics, - 2013, - Vol. 66, - P. 623-36.3. O.N. Koroleva, E.V. Dubrovin, A.P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
