Автореферат (1102289), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Работа изложена на 110страницах, содержит 48 рисунков и 2 таблицы.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВо введении содержится обоснование актуальности темы диссертации;определяются поставленные цель и задачи; излагается научная и практическаязначимость работы, положения, выносимые на защиту, личный вкладдиссертанта, а также апробация работы.В первой главе проводится литературный обзор работ по темедиссертации. Излагается описание предмета исследований – белка σ70субъединицы РНК-полимеразы E.
сoli и его агрегатов, а также процессаагрегации белков в целом. Приводится описание амилоидов как возможногорезультата агрегации белков. Вторая часть обзора посвящена методологииисследования, а именно атомно-силовоймикроскопии, как основномуприменяемому методу.Вторая глава посвящена описанию палочкообразной агрегации σ70субъединицы РНК-полимеразы E. coli. С помощьюАСМ визуализированымономеры белка σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coli, а также обнаруженыпалочкообразные агрегаты диаметром 5,4 ± 0,2 нм и большим разбросом длины(рисунок 1).АСМ-изображения с высоким пиксельным разрешением, полученные припониженных значениях амплитуды вынужденных колебаний кантилевераотносительно его амплитуды колебаний при первичном контакте с8Рисунок 1.
АСМ-изображение палочкообразных агрегатов σ70-субъединицы РНКполимеразы E. coli.поверхностью (то есть соответствующих повышенной силе механическоговзаимодействия кантилевера с образцом) позволили наблюдать спиральнуюструктуру палочкообразных агрегатов (рисунок 2).Рисунок 2. АСМ-изображения мутанта σ70–субъединицы, полученные сканированиемна воздухе.Анализ АСМ-данных спиральных фибрилл дикого типа исследуемогобелка и его мутантов показал, что шаг спирали (размер витка) составляет 20 ± 59нм, и что все полученные спиральные фибриллы белка и его мутантов являютсялевозакрученными.Для оценки интенсивности палочкообразной агрегации был подсчитанобъем различных форм адсорбированного белка и определена массовая доляагрегатов в предположении одинаковой плотности белка, находящегося вразных формах.
Содержание палочкообразных адсорбатов σ70-субъединицы израствора с концентрацией NaCl < 2 мМ на поверхности слюды оказалось впределах 0-1% в зависимости от конкретного образца. Такое незначительноесодержание, как правило, оставляет их незамеченными при исследованиитрадиционными методами, применяемыми в молекулярной биологии (гельэлектрофорез, хроматография и т.д.), тогда как АСМ позволяет увидетьбелковые ассоциаты даже при чрезвычайно низкой концентрации в растворе.Существенное увеличение количества адсорбированных молекул белка (в5-10 раз) наблюдалось при его нанесении на поверхность слюды из раствора 20мМ NaCl, 5 мМ MgSO4. Повышение физической адсорбции белка сувеличением концентрации электролита, судя по всему, происходит врезультатеэкранированияэлектростатическогоотталкиваниямономеровотрицательно заряженной σ70-субъединицы друг от друга и от поверхностислюды.
Так, для концентрации раствора электролита 20 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4содержание адсорбированных палочкообразных агрегатов возросло до 8%.Для хранившегося 3 месяца в растворе глицерина при температуре -20°С(рисунок 3) препарата σ70-субъединицы наблюдались как палочкообразныеагрегаты (приблизительно в том же количестве, что и на свежем образце), так идругие бесформенные образования.Это позволяет сделать вывод о том, что хранение в данном случае неявляется фактором роста палочкообразных структур.Сцельюопределитьвлияниеионнойсилынаинтенсивностьпалочкообразной агрегации σ70-субъединицы был исследован раствор белка приразличных концентрациях солей, обычно содержащихся в клетке (NaCl,10Рисунок 3. АСМ-изображение σ70-субъединицы РНК-полимеразы, нанесенной израствора (20 мM NaCl, 5 мM MgSO4) в концентрации 160 (a) и 55 (b) мкг/мл.
(a) - свежийпрепарат, (b) – препарат, хранившийся в течение 3-х месяцев в глицерине притемпературе -20°С.MgSO4). σ70-субъединица является отрицательно заряженной при нейтральномзначении pH, так же, как и слюда в воде, и положительно заряженные ионыслужатвкачествемостикамеждубелкомСледовательно, увеличение концентрациииповерхностьюслюды.электролита в определенныхпределах должно приводить к увеличению адсорбции белка.
Анализ большогоколичества АСМ-изображений (>100) подтвердил, как мы и предполагали,увеличениеагрегациипалочкообразныхструктурприувеличенииконцентрации NaCl и добавлении MgSO4. На гистограммах (рисунок 4)представлены распределения по длинам палочкообразных агрегатов σ70субъединицы, нанесенных из растворов, содержащих 2мM NaCl (слева), и20 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4 (справа).Впоследнемслучаеможноотметитьпоявление"хвоста"нараспределении в области больших длин. Это означает, что при увеличении11концентрации Na+ и добавлении Mg2+ в раствор белка на слюде появляютсяболее длинные агрегаты, в то время как средняя их длина остается прежней.Число палочкообразных1086420050100150200250300Lengthof sigma polymers,nmнмДлина палочкообразныхагрегатов,бsigma polymersNumber of агрегатовЧисло палочкообразныхaNumber of агрегатовsigma polymers1214121086420050100150200250300Длина палочкообразныхагрегатов,Lengthof sigma polymers,nmнмРисунок 4.
Распределение по длинам палочкообразных агрегатов σ70-субъединицы,нанесенных из растворов, содержащих (a) 2мM NaCl, (б) 20 мM NaCl, 5 мM MgSO4.Для исключения “эффекта подложки” из слюды на образованиепалочкообразныхагрегатовпринанесениирастворабелкатакжеиспользовалась поверхность гидрофобного и электрически нейтрального (вотличие от отрицательно заряженной в воде слюды) высокоориентированногопиролитического графита (ВОПГ). В этом случае также наблюдалисьпалочкообразные агрегаты диаметром около 5 нм и длиной 50-200 нм, ихсодержание среди всей массы адсорбированных молекул белка из раствора20 мM NaCl, 5 мM MgSO4 составило приблизительно 5% (рисунок 5).Дляподтвержденияамилоиднойприродыобразованныхσ70-субъединицей агрегатов были проведены эксперименты по их нерастворимостив додецилсульфате натрия (ДСН) и специфическому окрашиванию Конгокрасным. Полосы со значениями молекулярной массы 140, 210, 280 кДа наэлектрофореграммах σ70-субъединицы в полиакриламидном геле и 10%-м ДСН,соответствующим олигомерам белка, свидетельствуют о нерастворимостиагрегатов белка.
Избирательное взаимодействие Конго красного с молекулами12Рисунок 5. АСМ-изображение σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coli, нанесеннойна ВОПГ.σ70-субъединицы привело к появлению красной линии (~540 нм) на оптическомспектре адсорбции красителя, что свидетельствует о наличии β-структур вагрегатах σ70-субъединицы и подтверждает их амилоидную природу.Для исследования роли N-концевого участка были изучены мутантныеобразцы белка с делециями ∆1-73 (D1, удалено 73 аминокислотных остатка отN-конца), ∆1-100 (D2, удалено 100 аминокислотных остатка от N-конца) и ∆74100 (D4, внутри удалено 26 аминокислотных остатка) (рисунок 6). Все три типамутантнойσ70-субъединицыпроявилиспособностькобразованиюпалочкообразных агрегатов, как и в случае с σ70-субъединицей дикого типа.Диаметр фибрилл исследованных мутантных белков оказался приблизительноодинаковым в пределах погрешности для всех и схожим с диаметром агрегатовσ70-субъединицы дикого типа (D1: 5,2 ± 0,2 нм; D2: 5,0 ± 0,2 нм; D4: 5,3 ± 0,2нм; дикий тип σ70-субъединицы: 5,4 ± 0,2 нм).
Однако наблюдалось различие вколичестве агрегатов. При оценке содержания палочкообразных структур вконкретном образце было использовано соотношение их объема к объему всех13участкиРисунок6.Расположениемутаций.Линейнаядиаграммаσ70-субъединицы.Определены неконсервативные (NCR) и консервативные (1,2,3,4) участки.
Показанааминокислотная последовательность участка 1.1.адсорбированных молекул белка. Необыкновенно высокая способность кформированию палочкообразных структур наблюдалась для мутанта D1:содержание агрегатов, адсорбированных на поверхность слюды из растворабелка, содержащего 20мM NaCl, 5мM MgSO4, достигало 76%, что почти в 10раз выше по сравнению с результатами для σ70-субъединицы дикого типа (8%).Содержание палочкообразных агрегатов для мутанта D2 составило 7%, для D4способность к фибриллообразованию оказалась промежуточной, содержаниеагрегатов составило 29%.Поскольку частично разупорядоченные участки внутри белка считаютсяпредпосылками к образованию амилоидов, частичная делеция участка 1.1(мутанты D1 и D4), по-видимому, ведет к дополнительному разворачиваниюмономера белка и обеспечивает более выгодные стерические условия дляагрегации. Повышение способности к образованию фибрилл в случае мутантовD1 и D4 также может быть объяснено экспонированием некоторыхамилоидогенных участков, которые обычно спрятаны и экранированы в σ 70субъединице дикого типа.
Ярко выраженный эффект возрастания числа14палочкообразных агрегатов для мутанта D1 показывает, что удаленный участок(1-73) может функционировать как локальный шаперон, защищающий белок отинтенсивной агрегации.На следующем шаге была исследована способность σ70-субъединицы и еемутантов к образованию агрегатов в различном солевом окружении. Для этихцелей были проведены эксперименты с образцами, полученными из растворов0-200 мM NaCl (для всех трех мутантных белков) и 0-50 мM MgSO4 (длямутанта D1). Поведение адсорбции агрегатов σ70-субъединицы в экспериментахоказалосьнемонотонным.Нарисунке7представленоколичествоадсорбированных палочкообразных агрегатов, нормированное на 1 мкм 2, какфункция концентрации NaCl (а) и MgSO4 (б) в растворе.
Все вариантымутантногобелкаимеютсходнуютенденцию:поначалуадсорбцияувеличивается до максимального значения при концентрации 20-40 мM NaCl,затем количество агрегатов спадает (рисунок 7 а). Повышение концентрациидвухвалентных ионов электролита приводит к умеренному увеличениюадсорбции агрегатов σ70-субъединицы, насыщения при этом не наблюдаетсяКонцентрация NaCl, мМ-2Поверхностная плотностьаадсорбции агрегатов, мкм-2адсорбции агрегатов, мкмПоверхностная плотность(рисунок 7 б).бКонцентрация MgSO4, мМРисунок 7.
Поверхностная плотность адсорбции палочкообразных агрегатов σ70субъединицы дикого типа и ее мутантных вариантов D1, D2, D4 как функция концентрацииNaCl (а) и MgSO4 (б).15Несмотря на широко распространенную практику АСМ-сканированиябелков на воздухе, подтверждение полученных результатов в водной средеявляется существенно важным, так как позволяет исключить эффекты,связанные с высушиванием белка. АСМ-изображения белка, исследованного вводном растворе, представлены на рисунке 8.Рисунок 8.
(a) АСМ-изображение и (b) монтаж АСМ-изображений мутанта D2 σ70субъединицы. Сканирование в растворе 40 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4. (c) Поперечное сечениеагрегата вдоль пунктира в (b).Диаметр(высота)фибриллD2-мутантасогласноданнымАСМ,полученным в жидкости, оказался равным 6,2 ± 0,6 нм, что немного большезначения, полученного на воздухе (5,4 ± 0,2 нм). Это может объясняться слабойусадкой агрегатов в процессе высыхания. Близкие морфология и размерыагрегатов, полученные при АСМ-исследовании σ70-субъединицы в водномрастворе и на воздухе, свидетельствует об отсутствии значительного влиянияпроцесса высушивания образца на морфологию и свойства палочкообразныхагрегатов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
