Автореферат (1102289)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

На правах рукописиКузьмина Наталья ВикторовнаАтомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицыРНК-полимеразы E. coliСпециальность 03.01.02 - «Биофизика», 03.01.08 - «Биоинженерия»АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукМосква, 2017Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ имениМ.В.ЛомоносоваНаучные руководители:Рууге Энно Куставич, доктор физикоматематических наук, профессор.ДубровинЕвгенийВладимирович,кандидат физико-математических наук.Официальные оппоненты:Толстихина Алла Леонидовна, докторфизико-математических наук, ФГУ ФНИЦ«Кристаллография и фотоника» РАН, и.о.заведующегосекторомсканирующейзондовой микроскопии.Летаров Андрей Викторович, докторбиологическихнаук,институтмикробиологии им.

С.Н. ВиноградскогоРАН, заведующий лабораторией вирусовмикроорганизмов.Батищев Олег Вячеславович, кандидатфизико-математическихнаук,ФГБУНИФХЭ РАН, заместитель директораинститута по научной работе.Защита диссертации состоится «8» июня 2017 года в 14.00 часов на заседаниидиссертационного советаМГУ.01.04 Московского государственногоуниверситета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинскиегоры, д.1, стр. 2, аудитория “ЦФА”.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московскогогосударственного университета имени М.В.Ломоносова и на сайте:https://istina.msu.ru/dissertation_councils/councils/28357490/Автореферат разослан «__» _______ 2017 года.Ученый секретарьдиссертационного совета,кандидат технических наукА.Э. Сидорова2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫРаботапосвященавыявлениюфизико-химическиххарактеристикагрегации σ70-субъединицы РНК-полимеразы E.

сoli.Актуальность исследованияПроцесс транскрипции в экспрессии генетического материала живыхорганизмов катализируется РНК-полимеразой и характеризуется сложнымвзаимодействием фермента с ДНК и различными белками. Инициациятранскрипции прокариот происходит после присоединения к РНК-полимеразебелка σ-фактора (σ-субъединицы). σ70-субъединица E. coli обеспечиваеттранскрипциюгенов,контролирующихиобслуживающихосновныевнутриклеточные процессы. За последние несколько лет собрано много данныхо структуре и функции σ70-субъединицы, в частности, получены структурыотдельных функциональных доменов.

В некоторых работах упоминается обобразовании агрегатов σ70-субъединицы и ее мутантов, однако без уточненияморфологии и свойств агрегатов.Многие белки склонны к формированию агрегатов, особый интерес средикоторыхвызываютамилоиды.Структурноамилоидыхарактеризуютсябольшим содержанием β-складок, морфологически наиболее часто встречаетсяфибриллярная форма, также отмечаются червеобразные и спиралевидныеструктуры. Кроме этого, характерными признаками амилоидов являютсяспецифическое взаимодействие с красителем Конго красный, вызывающеекрасное смещение в спектре адсорбции с 490 нм на 530-540 нм, специфическоесвязывание с тиофлавином Т и нерастворимость в большинстве растворителей(в частности, в додецилсульфате натрия).

Амилоиды на протяжении уженескольких десятилетий являются предметом разносторонних исследований идискуссий. Наиболее часто встречаемые случаи амилоидной агрегации связаныcзаболеваниямичеловека,такимикакнейродегенеративныеболезниАльцгеймера, Паркинсона, Хантингтона; диабет второго типа и др. Однако впоследние годы стало ясно, что при определенных условиях амилоиднуюформу могут иметь чуть ли не все белки. Хотя амилоиды могут вырасти из3различных по своим функциям и структуре белков, тем не менее, все ониимеют много общего: амилоиды устойчивы к воздействию денатурирующихагентов и протеаз, имеются данные об их способности к самосборке истабильности при высоких температурах (вплоть до 140˚С).

В связи свыдающимися механическими свойствами амилоидных фибрилл предлагаютсяразличныебиоинженерныенаправленияихиспользования:созданиенаноструктурированных пленок с прочностью, сравнимой с прочностью шелка;использование амилоидных фибрилл в качестве ориентирующей матрицы дляорганических солнечных элементов; создание на их основе электрическойнанопроволоки посредством нанесения наночастиц золота и многое другое.Работ по систематическому исследованию агрегации σ70-субъединицыранее не проводилось.

Установление амилоидной природы и описаниеморфологии и свойств агрегатов σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coli и еемутантовпомогутформированияприблизитьсяамилоидныхкпониманиюфибрилл,регуляциипосколькуихпроцессафактическаясамоорганизация контролируется сложным взаимодействием физических ихимических факторов. Механизм агрегации, движущая сила и молекулярныеосновы физических свойств амилоидных фибрилл являются актуальнымизадачами на сегодняшний день, решение которых приведёт к созданию новыхвозможностей для применения в медицине и технологии.Цель и задачи исследованияЦель работы: выявление физико-химических характеристик агрегацииσ70-субъединицы РНК-полимеразы E. сoli.В этой связи основными задачами работы являлись:1) Исследование морфологии агрегатов белка σ70-субъединицы РНКполимеразы E.

сoli методом атомно-силовой микроскопии и сравнениес данными литературы, касающимися морфологии агрегатов другихбелков.42) Исследование зависимости интенсивности агрегации σ70-субъединицыРНК-полимеразы E. сoli от времени хранения белка и ионной силыраствора.3) Исследование агрегации мутантных вариантов σ70-субъединицы РНКполимеразы E. сoli для выяснения роли различных участков белка вагрегации.4) Выявление биотехнологически значимых аспектов агрегации σ70субъединицыРНК-полимеразыE.сoli,благоприятствующихинтенсивному формированию агрегатов.5) Анализмеханическихсвойствчервеобразныхагрегатовσ70-субъединицы РНК-полимеразы E.

сoli.6) Построение модели агрегации σ70-субъединицы РНК-полимеразы E.сoli.Научная новизна исследования1) Впервые обнаружена амилоидная палочкообразная агрегация σ70субъединицы РНК-полимеразы E. сoli и определены условия,благоприятствующие интенсивному формированию агрегатов.2) Впервые охарактеризованы трёхмерная морфология и физическиесвойства агрегатов σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. сoli.3) Впервые изучено влияние N-концевого участка σ70-субъединицы РНКполимеразы E. сoli на её агрегацию.4) Впервые предложенная модель агрегации σ70-субъединицы РНКполимеразы E.

сoli позволяет объяснить полиморфизм образуемыхбелком агрегатов.Методы исследованияЦентральным методом исследования в работе является атомно-силоваямикроскопия.Дополнительноприменялисьнезависимыеметоды:просвечивающая электронная микроскопия, деполяризованное динамическоерассеяние света, электрофорез, спектрометрия, молекулярная динамика.Научная и практическая значимость работы5Амилоиднаяагрегацияσ70-субъединицыРНК-полимеразыE.coli,обнаруженная в бактериальной системе, расширяет класс амилоидогенныхбелков.Определение пространственной структуры амилоидных агрегатов σ70субъединицы и анализ влияния солевого окружения на фибриллообразованиепозволитвыявитьнекоторыеобщиезакономерностиформированияамилоидных структур разных типов белков и их уровней организации иприблизиться к пониманию регуляции этого процесса.

Кроме того, агрегацияσ70-субъединицы может быть связана с регуляцией транскрипции в клетке.Наконец, возможность создания амилоидных фибрилл in vitro на основенетоксичных белков востребована для большого спектра технологическихприложений. В частности, благодаря особым физико-химическим свойствам,амилоидные фибриллы σ70-субъединицы могут быть использованы длясоздания молекулярных архитектур в молекулярной электронике и другихнанобиотехнологических приложениях.Положения, выносимые на защиту1) σ70-субъединица РНК-полимеразы E.

coli способна к спонтанномуобразованию in vitro, в том числе, при условиях, близких кфизиологическим,двухвидовагрегатов:амилоидоподобныхпалочкообразных агрегатов и червеобразных структур.2) Электростатические взаимодействия играют важную роль в агрегацииσ70-субъединицы.3) Разупорядоченные участки N-концевого домена σ70-субъединицыпрепятствуютинтенсивнойагрегациибелка;использованиемутантного варианта белка, частично или полностью лишённого этогоучастка, позволяет значительно улучшить формирование амилоидныхагрегатов.4) С помощью предложенной модели “кофейных чашек” можнообъяснить полиморфизм и пути формирования того или иного типанаблюдаемых агрегатов белка.6Достоверность изложенного в диссертации материала обеспечиваетсяиспользованием широко апробированных подходов и методов.

Результатынаходятся в соответствии с данными, полученными ранее другими авторами.Личный вклад диссертантаАвтор лично проводил анализ литературных данных, участвовал впостановке задач исследования, планировании и проведении экспериментов,получении результатов и выводов, подготовке публикаций и докладов нанаучных конференциях по теме диссертационной работы.Участие автора в исследовании: Подготовка образцов для АСМ-сканирования, получение АСМизображений, их обработка и анализ были проведены автором лично. Данные просвечивающей электронной микроскопии были полученысовместно с Абрамчуком Сергеем Савельевичем, а также КорнеевымДенисом Владимировичем. Анализ данных деполяризованного динамического рассеяния светапроводился совместно с Лаптинской Татьяной Васильевной.Апробация работыМатериалы исследования опубликованы в рецензируемых научныхизданиях, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus, RSCI (3статьи) и в сборниках тезисов докладов и конференций (9 публикаций).Основные результаты работы доложены на следующих конференциях:Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодыхученых "Ломоносов-2011", Москва, 11-15 апреля 2011; 17-й международныйбиофизический конгресс, Пекин, 30.10-03.11.2011; Ломоносовские чтения,Москва, 14-18 апреля 2014; 7-я международная конференция "Современныедостижения бионаноскопии", Москва, 17-19 июня 2014; 18-й Международныйконгресс по микроскопии, Прага, 7-12 сентября 2014; Международнаяконференция “Super resolution in different dimensions”, Москва, 2-3 июня 2015;Всероссийская научная молодежная конференция “Актуальные проблемы инано- и микроэлектроники”, Уфа, 1-4 декабря 2015; Восьмая международная7конференция “Современные достижения бионаноскопии”, Москва, 15 июня2016.Объём и структура диссертацииДиссертация состоит из введения, 4 глав, результатов и выводов, спискасокращений и списка цитируемой литературы.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации