Отзыв официального оппонента 3 (1102281)
Текст из файла
отзыв официального оппонента Батищева Олега Вячеславовича на диссертационную работу Кузьминой Натальи Викторовны «Атомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицы РНК-полимсразы Е.сой», представленной на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальностям 03.01.02 - «Биофизика»,03,01.08 - «Биоинженерия» Диссертационная работа Кузьминой Н,В, выполнена в русле одного из актуальных направлений современной биофизики и биоинженерии — изучение природы формирования амилоидных фибрилл из различных белков и полипептидов и поиск способов управления этим процессом, как для лечения различных заболеваний, так и для перспективных биотехнологических приложений.
В качестве основного объекта исследований в данной работе была выбрана сигма(70)-субъединица РНК-полимеразы Е.сой, играющая важную роль в процессе транскрипции генетического материала бактериальных клеток. Данный белок достаточно хорошо изучен с функциональной точки зрения, однако процесс его агрегации в различных условиях, морфология таких агрегатов, а также условия их перехода в амилоидные формы до сих пор оста«>тся невыясненными. Выявлению физико- химических основ этих процессов как раз и посвящена диссертационная работа Кузьминой Н,В. Для этого в работе исследована морфология агрегатов сигма(70)- субъединицы РНК-полимеразы Е,сой в зависимости от свойств среды и условий хранения препарата, изучены механические свойства таких агрегатов, а также исследованы различные мутанты данного белка е целью установления ключевых участков, ответственных за его агрегацию.
Кроме того, в работе была предложена модель формирования агрегатов сигма(70)-субъединица РНК-полимеразы Е.сой и выявлены условия, способствующие интенсификации данного процесса, В качестве основного метода в работе была выбрана атомно-силовая микроскопия, позволяющая получать информацию о структуре исследуемых объектов с нанометровым разрешением. Эти исследования были дополнены другими методиками, такими как электронная микроскопия, спектрометрия, молекулярная динамика и т.п., что позволило построить достаточно полную картину процесса агрегации исследуемого белка и его мутантных форм, Диссертационная работа представлена в традиционном стиле и изложена на 110 страницах, содержит 48 рисунков и 2 таблицы.
Она состоит из введения, 4 глав, результатов и выводов, списка сокращений и списка цитируемой литературы. Библиографический список включает 137 наименований. Вводная часть диссертации и обзор литературы достаточно аргументировано излагают выбор основного направления и объектов исследования, экспериментальных методов и способов анализа полученных результатов. Обзор литературы состоит из четырех разделов.
Первый раздел посвящен функциональной роли РНК-полимеразы в жизненном цикле прокариот, и, в частности, описанию структуры и функций сигма(70)- субъединицы РНК-полимеразы Есо1~. Во втором разделе рассматриваются механизмы агрегации белков, где основной акцент сделан на амилоидную агрегацию. Рассматриваются характерные особенности амилоидов, такие как специфическое взаимодействие с Конго красным, приводящее к смещению спектра поглощения данного красителя с 490 нм на 530-540 нм, специфическое связывание с тиофлавином Т, а также нерастворимость в большинстве растворителей и устойчивость к высоким температурам.
Приведены примеры белков, склонных к амнлоидной агрегации, возможные механизмы такой агрегации, а также связанные с этим процессом заболевания и возможные прикладные аспекты применения амилоидной агрегации в электронике и создании новых сверхпрочных материалов. В третьем разделе обзора литературы описываются методы исследования амилоидных структур, позволяющие получить достаточно высокое пространственное разрешение.
К таким методам относятся атомно-силовая микроскопия и просвечивающая электронная микроскопия. Описаны основные принципы работы данных методов, а также приведены примеры их применения для изучения амилоидных фибрилл, формируемых различными белками. Последний, четвертый раздел обзора литературы более подробно описывает применение метода атомно-силовой микроскопии для исследования процессов формирования амилоидных фибрилл.
Представлены описания исследований стадий агрегацин белков„разнообразия форм получаемых фибрилл и характерные особенности их строения. В целом, обзор литературы демонстрирует достаточную компетентность автора в данной области. В нем охвачены как основные методы, используемые для структурного анализа амилоидных фибрилл, так и ключевые особенности формирования подобных агрегатов, рассмотренные на примере многих различных белков. Показана значимость выбранного предмета исследований и необходимость получения более полной информации о физико-химических механизмах агрегации сигма(70)-субъединица РНК- полимеразы Е.сой для расширения представлений о классах возможных амилоидных белков.
Экспериментальная часть диссертации, основные результаты и их обсуждение разнесены по главам 2, 3 и 4. Глава 2 посвящена исследованию палочкообразной агрегации о70-субъединицы РНК-полнмеразы Е. со11 и содержит основную массу полученных экспериментальных данных. Показано, что при адсорбции на поверхности слюды данный белок может присутствовать как в виде мономеров, так и в виде различных агрегатов, в том числе палочкообразной формы. Путем подбора режима сканирования было установлено, что данные палочкообразные агрегаты представляют собой левозакрученную спираль, что соответствует хиральности описанных в литературе амилондных фибрилл.
Изучена зависимость процесса адсорбции исследуемого белка от ионной силы раствора и условий хранения исходного препарата. Показано, что повышение ионной силы раствора и наличие солей двухвалентный металлов повышает плотность адсорбционного слоя белка и долю палочкообразных агрегатов, в то время как длительное хранение образца практически не влияет на процесс формирования подобных агрегатов. В целом, представленные данные подтверждают гипотезу о склонности сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы Е.со11 к амилоидной агрегации в физиологических условиях.
Дальнейшие исследования взаимодействия данного белка с красителем Конго красный независимо показали наличие 13-структур в растворе белка, характерных для амилоидных агрегатов. Эксперименты по гель-электрофорезу показали, что длительное хранение образца белка приводит к формированию в нем аморфных агрегатов. Важной частью работы является исследование различных мутантов сигма(70)- субъединицы РНК-полимеразы Е.со11, что позволяет более точно установить участки белка, ответственные за амилоидную агрегацию. Для того, чтобы предложить модель агрегации амилоида сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы Е.
со11, исследовалась роль Х-концевого участка. С этой целью использовались мутантные образцы белка с делециями Л1-73 (Р1) (удалено 73 аминокислотных остатка от Х-конца), Л1-100 (132) (удалено 100 аминокнслотных остатков от Х-конца) и Л74-100 (134) «внутри удалено 26 аминокислотных остатков). Все три мутанта проявляли склонность к формированию палочкообразных агрегатов приблизительно равного диаметра, однако общее количество таких агрегатов сильно различалось. Наибольшая склонность к агрегации наблюдалась у мутанта Ш, близкая к ней — у мутанта 04. Автором делается вполне разумное предположение, что именно те участки нативного белка, которые были удалены в этих мутантах, и препятствовали более сильной амилоидной агрегации белка дикого типа. Важным элементом работы является проверка полученных результатов при сканировании на воздухе экспериментами в водных растворах, что позволяет исключить возможные артефакты, связанные с высушиванием белка.
Данные о размерах формируемых палочкообразных агрегатов нашли независимое подтверждение в экспериментах по просвечивающей электронной микроскопии, Третья глава посвящена исследованию червеобразных агрегатов сигма(70)- субъединицы РНК-полимеразы Е. сой„по-видимому„представляющих собой предшественников амилоидных фибрилл данного белка. Была изучена морфология таких структур. представляющих собой «бусины на нити». Для выявления роли обнаруженных червеобразных структур в формировании зрелых амилоидных фибрилл была проведена оценка механических свойств и сравнительный анализ с литературными данными протофибрилл других белков.
Были проанализированы персистентная длина червеобразных структур и их модуль Юнга в зависимости от ионной силы раствора. Характер зависимости персистентной длины от ионной силы отвечал поведению заряженных полимеров в растворе. Полученные значения модуля Юнга показали, что, несмотря на способность исследуемого белка к амилоидной агрегации, его протофибриллы значительно более гибкие, чем у других белков. Моделирование методами молекулярной динамики показало, что «бусины» на червеобразных структурах, наблюдаемые методом атомно-силовой микроскопии, скорее всего, представляют собой димеры исследуемого белка.
Оценки морфологии червеобразных структур, полученные по данным полн оатомного моделирования, находятся в хорошем соответствии с результатами экспериментов по атомно-силовой микроскопии. В последней, 4-й главе, предпринята попытка объяснить молекулярный механизм построения амилоидных фибрилл сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы Е. сой. Предложена модель так называемых "кофейных чашек", в которой "ручка" и "чаша'* соответствуют частично разупорядоченному участку и структурированной глобуле, соответственно. Данная модель подразумевает наличие внутри белка двух "самокомплементарных" участков, обеспечивающих самосборку белка. Эта модель объясняет как наличие димера в качестве основной структурной единицы, так и возможность формирования спиральных структур при замыкании цикла молекул белка.
В разделе «Заключение и выводы» сформулированы основные результаты работы, к которым относится как сам факт обнаружения амилоидной агрегации сигма(70)- субъединицы РНК-полимеразы Е. сой, так и объяснение молекулярного механизма этого процесса и результаты исследований его зависимости от ионной силы раствора и содержания двухвалентных катионов. В завершении сформулированы основные выводы диссертации. Резюмируя вышесказанное, можно вьщелить основные положительные качества диссертации, Работа выполнена на хорошем экспериментальном уровне с привлечением целого ряда достаточно сложных методов, таких как атомно-силовая микроскопия, электронная микроскопия, спектроскопия, молекулярная динамика и т.д.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
