Отзыв официального оппонента 1 (1102279)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

официального ошюнснта Лстарова Андрея Викторовича на диссертационную работу Кузьминой Натальи Викторовны «Атомно-силовая микроскопия сигма('70)-субъединицы РНК-полимеразы Е.сойв на соискание степени кандидата физико-математических наук по специальностям 03,01.02 — биофизика, 03.01.08 — биоинженерия Объектом исследования в диссертационной работе Кузьминой Н.В.

является сигма(70)-субъсдиница РНК-полимеразы Е.сой, белок, необходимый для формирования холофсрмепга РНК-полимсргсзы и инициации транскрипции в бактериальной клетке. Амилоидпая агрегапия сигма(70)-субъединицы, обнаруженная и исследованная соискателем, является редким примером амилоидной аг)х,*гации бактериальных белков. Общность механизмов амилоидной агрсгацни, которая является причиной ряда прионных заболеваний ~ело~с~а. Та~и~ как нсиродегене)зативиыс болезин Альцгеймера, Паркинсона, Хлитинггона, диабцг второго типа и др., делаккг особенно актуальными проведенные в )заботе исследования.

Кроме того„амилоидные фибриллы Ооладают хорощими механическими свойствами, что является привлекательным фактором для их использования в Оиониженсрии. Например, для ~о~дания иапопроволок или пленок. Нс вызываст СОмнения и иаучиая новизна дисссртационгюй работы'. соискателем впервые обнаружена палочкообразная агрегация сигма(70)-субъедииицы РНК-полимсразы Е.сой, из)"чсн полиморфизм агрегатов згого белка, Определены их морфологические и механические характеристики, выявлена роль ))-конца в а|регации.

Наконец, впервые предложена модель, одновременно объяснякзщая два нути агрегации данного белка: амилоидиый и неамилоидный. Эта модель может быть применима и к друз им склонным к полиморфизму агрегатов белкам. Практическая значимость научной работы Исследованные в диссертационной работе механизмы амилоидной гнрегации сигма(70)-субъединицы РНК-полимсразы Есой вносят вклад в понимание механизмов амилоиднОЙ аг)хчзщии в целом. В зависимОсти От сфс)зы потснцивльнОГО применения, такое понимание необходимо как для развития стратегий разрупгсния амнлоидных фпбрилл (зто, безусловно, востребовано в медицине для лечения или предотвращения вызванных амилоидозом заоолсваний), так и.

Наоборот, для стимулирования формирования таких фибрилл (например„для биотехнологий). Одна из задач диссерзиции, как раз, напрямук) связана с выявлением биотехиологически значимых аспектов агрсгации сигма(70)-субъединицы, благоприятствукицих интенсивному формированию агрегатов. Достоверность полученных в работе результатов оосспечивается их высокой воспроизводимосзыо, соотвстствисм )х зультатОН, полученных ргкзличнь|ми методами (таких как атомно-силовая микроскопия„просвечивакицая злсктронная микроскопия, динамическое рассеяние света.

гель-злек-грофорсз и лр.)„в различных средах (как на воздухе, так и в воднь1х растворах), а также согласукицимся с обцн1ми физическими прингипгами поведением харакгеристик белковьгх агрегатов, полученных при различных условиях (таких как ионный состав и ионная сила раствора).

Структура и содержание работы Диссертационная работа Кузьминой Н.В. имеет общепринятую структуру н сосп1ит нз введения. чпгь!Рдх глав, заключения н выводов и списка цитируемой л1ггератур14. Первая глава посвящена литературному обзору, и в нйм рассмотрены вопросы, являющиеся прелметОМ исследоВания диссертации: Описана структура и функции сигмасубьедйниц РНК-полймераз, приведены основные сведения об амилоидной агрегацни, рассмотрены вопросы применения метода атомно-силовой микроскопии (ЛСМ), как основному применяемому методу, к изучению амилоидной агрский белка, Объйм и содержапйе литературно! О обзора пре11ставлякггся хор11ц1О обусловлеййымй содержанйем зкспернментальной части работы.

ВО вто)1ОЙ главе проведен подробный айалйз палочкообразйой агрегацйй сигма(70)-субъеднницы РИК-полимеразы ЕС1н!'. Во-первых, с помощью ЛСМ визуализированы с высоким пространственным разрец!синем палочкообразные агрегаты н продемонстрирована йх сннралызая левозак)1учеййая с!рукгура.

Во-вто)зых, сравнительный ЛСМ-анализ агрегатов белка сигма(70)-субъелйницы, выполненный на разных подложках (слк1да, графит) н в разных средах (воздух и водный раствор) НОдтвсрд31л наличи1". Н1н1очк1юбразных азрегатов й 1юзВОлнл исклк1чить Основанную на аргефакгах интерпретацию ЛСМ-изображений, связанную с высушиваннем образца илй влиянием поверхности какой-то конкретной подложки. Соглащю данным по связыванию с красителем Конго красным, палочкообразные агрегаты имеют амилоидную природу. В- третьих„проведен анализ зависимости плотности адсорбции палочкообразных агрегагов белка в зависимости от концентрации солей в растворе. Эта зависимость позволила сделать выв11д об условиях, благоприятствующих палочкообразной агрегацнн.

Наконец, образование палочкообразных агрегатов было независимо подтверждено с помощью просвеап1ваю1цей зз!Сктронной микроскопии и деполярнзованно1 о динамического рассеяния света. Еще одним вопросом„изложенным во второй главе, является исследование мутантных Видов си!ма(70)-субъединнцы, полностью или частично лишенных )ч-конца. Такое псследованйе было проведено с целью выявления роли )з-конца в агре!'щии и уточнения сй мехаййзма. Результаты ЛОМ-йсследоваййя а1-регатов мутайтйь1х вйдов белка продемонстрировали существенное увеличение агре!ации мутантных сигма(70)- субъедйййц, что позволйло сделать вывод О стаойлйзйрук1щей )золй ))-конца, который предотврщцает интенсивну1о палочкообразнук! агрегапню.

Совокупность представленных ВО второй главе данных свидетельствует о наличии палочкообразной амилоидной агрегацни сигма(70)-субьеднннцы, демонстрирует Особеййостй мехаййзма такоЙ агрегацйн й четко определяет морфоз!Огйческйе особейпостй а!Регатов.

Третья глава посвлцини исследованию червеобразной агре!-анни сигма(70)- суоъедйнйцы. Охаракгсрн1ована структура червеобразных агрегатов„ймею~йх форк1у бусин на нити. Кроме того, определены механические свойства червеобразных агре!азов (такйе как модуль К)нга, пе)1сйстент!щя длййа) й йх завйсймость От йоййОЙ сйлы раствора. Относительно низкие значения модуля РОнга (лежащие в диапазоне 7,8 — 12,3 МПа) позволили соискателю предгюложйть неамнлоидную природу червеобразных агрегатов, В четвертой ! Лаве предложе!щ иерархическая модель ккофсйпых чашек», которая учитывает н объединяет полученные в предыдущих главах диссертащюнной работы 1ксперименгальные результаты. Данная модель подразумевает наличие внутри белка двух "самокомнлсмептарных" участков, обеспечнвакнцих самосборку белка, Лмилонлогенный белок пренс.ивлсн в виде '"кофейной чашки'.

в котором "ручка" и "чаша" соответствуют частично разупорядочеиному участку и структурированноЙ глобуле, соответственно, Согласно да«щой модели, сборка осуществляется либо в виде спнршщ 1что соответствует палочкообразной агрсгацни) либо в внле разветвлдиной цепи 1что соответствует червеобразноЙ агрегацни). ~ри всех присущих работе достоинствах в диссертации имеется ряд недостатков. 71итературный обзор уделяет больп«ое внимание технической стороне атомно-силовой микроскопии„в том числе, например.

техно«щггии изготовления канззп«еве)х«в. В 'го же время более релевантные летали, такие как калибровка размеров н оценка «ффекта расширения обьсктов в плоскости сканирования не освещены совсем. Информация о применениях ЛСМ в биологии в оозоре присутствует. но дана крайне скупо. В исследования «щ мой взгляд ие достаточно ст1«огих доказательств.

исследуемые палочкгк«бразные структуры деиствительио состоят из белка щи ма-70, а ие представлены загрязнением белковой или небелковой природы. Это заюпочение косвенно следует из злекгрофореграмм, котт«рые показываи«т, что в свежлх образцах белок является фактически гомогеиным. В то «ке время, если бы авто)«ы отделили данные агрегаты путем промывки на мембранном концентраторе, подтвердили бы с помощью микроскопии, гго в препарате отсутс.гвуют аморфные агрегаты и„наконец, идентифицировали белок с помощью МЛ 'ь«1грОЕ спектроскопии пептидов, то все сомнения были бы полностью разреп«е««ьь В зкспернменте по связыванию с препаратами белка сигма-70 красителя Конгокраспый также имеется ряд неясностей.

Судя по приведенным спектрам, лишь небольшая часть красителя связалась в белком и претерпела сдвиг максимума поглощения. Для более уверенной интерпретации згих данных не хватает контроля с белком, заведомо пе образу«ощим амилоидных структур 1иап1«име)«, с тем же сигма-70, п1х«пущенным через мембрану 100 КДа), а также с заведомо амилонлным белком, взятом в количестве, сопоставимым с оцененным количеством палочкообразных агрегатов в исследуемом ц1«епарггге. Из описания эксперимента с ДСН-НЛЛГ злектрофорезом не ясно, исследовались лн одни и те же препарать«. или свежиЙ и хранившиЙся препараты были из разных партиЙ. В последнем случае необходимо доказательство воспроизводимости количества агрегатов от выделения к выделению.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации