Технология получения текстильных и гидрогелевых депо-материалов с радиопротекторными свойствами (1095146), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Поглощенная доза для разбавленных растворов альгината натрия составляла 400 Гр, а для концентрированных 7 – 10 кГр.2.2.16 Методика определения наличия в альгинате натрия естественных примесей(хлорофилла, каротиноидов)С целью выявления возможного влияния на радиационную устойчивость растворов альгината натрия естественных примесей полимера в данной работе было проведено спектрофотометрическое исследование наличия в его составе хлорофилла и каротиноидов [229] с использованием спектрофотометра марки «СФ-2000». Методика испытания приведена в приложении А.692.2.17 Методика определения наличия в альгинате натрия ионов металлов переменнойвалентности (железо, медь, цинк)С целью выявления возможного влияния на радиационную устойчивость растворов альгината натрия примесей ионов металлов переменной валентности в данной работе было проведено исследование их наличия в его составе.
Определение наличия ионов железа (II) проводилиспектрофотометрическим методом на спектрофотометре марки «СФ-2000» [230], ионов меди ицинка – полярографическим методом на вольтамперометрическом анализаторе АВС-1.1 [231,232]. Методика испытания приведена в приложении А.2.2.18 Методика оценки радиопротекторной активности альгината натрия по отношениюк модельной системе (дрожжевые клетки)Радиопротекторную активность оценивали по относительному изменению выхода ионовкалия из облученных дрожжевых клеток в питательную среду. Об использовании выхода ионовК+ для оценки поражения клеток и, в частности, оценки состояния плазматической мембраны удрожжей упоминается в работах [96, 233].
В работе использовали диплоидные дрожжиSaccharomyces cerevisiae расы Феодосия-7 в логарифмической фазе роста, методика получениякоторых представлена в приложении А. В 10 мл дрожжевой суспензии вводили исследуемыевещества в концентрации 10-5 моль/л в виде спиртовых растворов с концентрацией 10-3 моль/л.Полученную систему подвергали воздействию γ-излучения 60Со на установке РХМ-γ-20, в дозе0,4 кГр и через сутки после облучения измеряли концентрацию ионов К + с помощью калийселективного электрода на pH-метре-иономере «Экотест 2000». Концентрацию ионов К + в растворе дрожжей, облученных без добавок, принимали за 100 %.2.2.19 Методика оценки антиоксидантной активности альгината натрия по изменениювыхода связывания кислорода при радиационно-инициированном окислении системыС учетом назначения разрабатываемых материалов необходимо было провести оценкуналичия антиоксидантной активности используемого в качестве полимерной основы создаваемых изделий альгината натрия.
Определение проводили с использованием анализатора жидкости – кислородомера АНИОН 7040, предназначенного для измерения биохимического потребления кислорода. В основу измерения концентрации растворенного кислорода положен амперометрический метод анализа. Концентрацию кислорода определяют по силе тока, протекающей в цепи электродной системы сенсора О2. Электроды, катод и анод, сенсора О2 находятся в70растворе электролита и отделены от анализируемой жидкости газопроницаемой мембраной.Кислород свободно диффундирует через мембрану, а электролит – к электродам, которые находятся под постоянным напряжением, поступающим от источника поляризующего напряженияприбора.
В цепи электродов возникает ток, который обусловлен реакцией восстановления молекулярного кислорода, протекающего по схеме [145, 234, 235]:О2 + 2 Н2О + 4е- = 4 ОН-(25)Ток преобразуется в напряжение, которое измеряется и, в свою очередь, преобразуется взначения концентрации кислорода.Для определения изменения концентрации растворенного кислорода нами была разработана следующая методика: раствор 5 % этилового спирта в воде с введенными исследуемымивеществами облучали в циркуляционной схеме с непрерывным определением концентрациирастворенного кислорода. Таким образом, при взаимодействии с радикалами будет происходить расходование растворенного кислорода.
При взаимодействии гидроксиалкильных радикалов с исследуемым акцептором будет происходить уменьшение выхода связывания кислорода,что будет свидетельствовать об антиоксидантной активности исследуемого соединения.2.2.20 Методики исследования антирадикальной активности полимеров,лекарственных препаратов и биологически активных соединенийИсследование антирадикальной активности (АРА) исследуемых соединений, свидетельствующей об их способности ингибировать протекание в организме под воздействием облучения радикально-цепных реакций с участием высокореакционноспособных свободных радикалов, проводили с использованием различных методик, позволяющих получить сравнительныеданные, в соответствии с которыми будет произведен выбор компонентов, включаемых впоследствии в разрабатываемые материалы.2.2.20.1 Методика определения антирадикальной активности с использованием радикала1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (растворитель – толуол)1)Для определения антирадикальной активности использовали раствор устойчивого свободного радикала 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (ДФПГ) с максимумом поглощения приλ = 517 нм, который исчезает при добавлении антиоксиданта (Рисунок 13) [236, 237, 238, 239].1)Работа проводилась в ФГУП «Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства (г.
Санкт-Петербург) под руководством к.х.н. ЧуриловойИ.В., которой мы благодарны за помощь в проведении эксперимента.71Оптическая плотностьРисунок 13 – Спектры поглощения раствора ДФПГ до (1) и после (2) введения антиоксидантаК 1,5 мл раствора исследуемого образца добавляли 3 мл раствора ДФПГ, через 5 минут впробы вносили 4 мл толуола. Для разделения фаз смесь центрифугировали на центрифуге MLWK23 (ГДР) в течение 10 минут при 1000 об/мин. Оптическую плотность (D) верхнего окрашенного слоя измеряли при длине волны λ = 517 нм относительно толуола.
Контрольная проба содержала 1,5 мл воды. Для расчета использовали разницу оптических плотностей контрольной иопытных проб. Количество антиоксидантов определяли по калибровочной кривой, для построения которой использовали раствор аскорбиновой кислоты. Полученные результаты выражали вмкМ аскорбиновой кислоты на г препарата.Аскорбиновая кислота является водорастворимым витамином и обладает свойствамисильного антиоксиданта. Данное соединение участвует в восстановлении ведущих эндогенныхантиоксидантов (таких как глутатион, мочевая кислота), которые служат главными ловушкамидля ОН радикалов в цитозоле клетки, функционируя в рамках регенерирующих циклов биоантиоксидантов. Также возможно существование прямого механизма инактивации ОН радикалааскорбиновой кислотой [240].
Измерения проводили на спектрофотометре СФ-26. Калибровочный график и данные для его построения приведены в приложении А.2.2.20.2 Методика определения антирадикальной активности с использованием радикала1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (растворитель – этиловый спирт)Согласно методике, описанной в литературном источнике [241], водный экстракт(0,1 мл) исследуемого вещества добавляли к 3 мл 0,004 % раствора ДФПГ в метиловом спирте,перемешивали и выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре без доступа света,после чего проводили измерение оптической плотности растворов при длине волны 517 нм.Активность ингибирования рассчитывается по следующему выражению:72ААо ААо,(26)где Ао – поглощение (оптическая плотность) раствора ДФПГ без экстракта,Aэ – поглощение (оптическая плотность) раствора ДФПГ с экстрактом.В данной работе был получен свежеприготовленный 0,2 мМ раствор ДФПГ в 98 % растворе этанола.
Для построения калибровочной кривой использовали свежеприготовленные водно-спиртовые растворы лекарственных веществ [239, 242]: содержание ЛП в 50 % раствореэтанола составило 1 мг/1 мл. Растворы приготовлены с разной концентрацией веществ в реакционной смеси (Таблица 9). В контрольные пробирки вместо добавок было внесено 2 мл 50 %раствора этанола. Реакция начиналась при добавлении в систему раствора ДФПГ.Таблица 9 – Приготовление водно-спиртовых растворов исследуемых добавокОбъём добавок, мл0,250,751,251,75Объём 50 % этанола, мл2,001,751,250,750,25Объём ДФПГ, мл2,00Пробирки встряхивали, после чего выдерживали их в течение 30 мин без доступа светапри комнатной температуре. По истечении указанного времени измеряли оптическую плотность растворов при длине волны 517 нм.2.2.20.3 Методика определения антирадикальных свойств веществ по их способностивзаимодействовать с супероксидным анионрадикаломДанный анализ основан на способности антиоксидантов ингибировать восстановлениепаранитротетразолия хлористого (ПНТХ) супероксидным анионрадикалом.
Для генерации последнего часто используют рибофлавин-содержащую систему. Этот метод был разработан [243]и в дальнейшем использовался после модификации [244] для определения супероксиддисмутазы. Согласно этому методу, для анализа использовали 3 мл реакционной смеси, содержащей50 мМ фосфатного буфера (рН 7,8), 13 мМ метионина, 2 мкM рибофлавина, 100 мкМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 75 мкМ ПНТХ и 1 мл раствора исследуемого образца.Через 10 мин при освещении люминесцентной лампой происходит образование синего формазана с максимумом поглощения при 560 нм. Реакционная смесь находилась в сосуде, облицованном алюминиевой фольгой.
Идентичные сосуды с реакционной смесью выдерживались втемноте и служили образцами сравнения. Процент ингибирования супероксиддисмутазы определяли путем сравнения показателя поглощения значений рабочих растворов и образцов.73В данной работе для определения активности исследуемых соединений по отношению ксупероксидному анионрадикалу готовили растворы, содержащие 5 % (по объему) этанола,37,5 мкМ ПНТХ и исследуемые вещества в различных концентрациях (исследовано по 4 концентрации) в фосфатном буфере с pH = 6,86 [245].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
