Захарова Н.Г. Полифункциональные биосовместимые материалы на основе магнетита и пектина (1006298), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Механическое разделение ингредиентов лимфыцентрифугированиемРазделение ингредиентов лимфы центрифугированиемБыли использованы 3 условия центрифугирования исходного образцалимфы (ЛимфаИСХ): (1) образец исходной лимфы - на лабораторнойвысокоскоростной центрифуге при 15000 об/мин в течение 10 мин (образецЛимфа1Ц);(2)образецисходнойлимфы,разведеннойв2разафизиологическим раствором при тех же условиях, что и в (1) (Лимфа2Ц);образец исходной лимфы в стерильном стандартном пластиковом сборнике -132при 2500 об/мин в течение 40 мин на центрифуге с охлаждением (Лимфа3Ц).Микрофотографииобразцовисходнойлимфыиконцентратапослецентрифугирования выполнены на лабораторном микроскопе Биомед-3 сфотонасадкой.Разделение ингредиентов лимфы микро- и ультрафильтрациейРазделениеингредиентовлимфыпроводилисиспользованиемфильтрационных устройств Pellicon XL Filter фирмы Millipore.
В работеиспользовали микрофильтрационные мембраны PELXL, размер пор – 0,22 μм;ультрафильтрационные мембраны с порогом отсечки 67 кД (трубчатыекерамическиемембранныекоротковолокнистыхфильтрынитевидныхнаосновемонокристалловα-Al2O3диоксидаввидециркония),перистальтический насос Minipuls 2 (Gilson, Франция), центрифугу (Fr1600).Наработку фракций лимфы проводили по следующей методике.Первоначально пробу исследуемого образца центрифугировали при 3000об/мин в течение 30 минут (образец Лимфа4Ц). Надосадочную жидкостьфильтровали через микрофильтрационную мембрану с порогом отсечки 0,22микрон(образецЛимфаМФ).Скоростьпротокажидкостичерезфильтрационное устройство составляла 36 мл/мин.
Пермеат фильтроваличерез ультрафильтрационную мембрану с порогом отсечки 67 кД (ЛимфаУФ).Затем образцы пермеата и фильтратов были проанализированы на остаточноесодержание ингредиентов лимфы.В таблице 4.4 приведены результаты экспериментов по механическомуразделению компонентов лимфы методами центрифугирования и мембраннойфильтрации.133Таблица 4.4. Содержание ингредиентов в образцах лимфы после обработкиисходной лимфыALT, Chol, GLU,TP,Trig, BiliT, Creat, AST,ОбразецU/лμMμMг/лмMμMμMU/л1 ЛимфаНОРМА0÷553,3÷6,2 3,89÷6,063÷870,2÷2,2 3,4÷20,5 57÷1202 ЛимфаИСХ1203,4443237,8563543 Лимфа1Ц<60,642,47326,985,159,94 Лимфа2Ц*<60,8844,58345,65,655,45 Лимфа3Ц<60,8642,723611,595,959,46 Лимфа4Ц<60,8741,4636н/о6,657,47 ЛимфаМФ<60,8942,0736н/о6,357,98 ЛимфаУФ<60,6941,9529н/о4,756,9* результаты для образца Лимфа2Ц представлены с учетом разбавления;** н/о - не определялось5÷3460161815222118В случае центрифугирования образцов исходной и разбавленной лимфынаблюдается образование трехфазной системы, состоящей из верхнего слоя липидных компонентов, среднего слоя – супернатанта (очищенная лимфа) инижнего слоя осадка, включающего форменные элементы.На рисунке 4.6 показаны результаты сравнительного анализа образцовочищенной лимфы, полученных методами центрифугирования и мембраннойфильтрации.Рисунок 4.6.
Диаграмма содержания компонентов (в %) в образцах лимфыЛимфа3Ц и ЛимфаУФ (супернатант)134Данные, представленные в таблице 4.4 и на рисунке 4.6, показывают,чтопредлагаемыемеханическиеспособыразделенияприводяткзначительному снижению содержания липидных и белковых компонентовлимфы. При этом концентрации исследованных белковых и липидныхкомпонентов в очищенной лимфе снижаются до их нормальных значений. Повидимому, белки сорбируются липидной фракцией исходной лимфы и примеханическом разделении суспензии попадают в верхний слой липидныхкомпонентов с плотностью менее 1 кг/м3. Концентрация глюкозы остаетсянеизменной.Образцылимфы,очищенныецентрифугированиемиультрафильтрацией, имели светло-желтый цвет с различной интенсивностьюопалесценции, что свидетельствует о присутствии в них нерастворимыхнаноразмерных частиц. На рисунке 4.7 приведены фотографии образцов,полученных после обработки центрифугированием при факторе разделенияg1600 (наибольшая мутность образца) и ультрафильтрацией (наиболеепрозрачный образец).
На рисунке 4.7а видно большое количество крупныхассоциатов и отдельных частиц липидной фракции, что приводит к мутностиизображения. Проведение процесса ультрафильтрации исходной фракцииприводит к исчезновению крупных липидных фракций, но сохранению болеемелких частиц (рис. 4.7б).абРисунок 4.7. Микрофотографии образцов (а) лимфы исходной (ЛимфаИСХ) и(б) пермеата (ЛимфаУФ) при увеличении в 640 раз135Такимобразом,(центрифугированиеипроведениемембраннаямеханическойфильтрация)обработкипозволяетснизитьсодержание исследованных белковых и липидных компонентов лимфы до ихнормальных значений.
Однако содержание глюкозы при указанных способахобработки остается неизменным.4.2.1.2. Очистка лимфы с использованием сорбентовПроцедура проведения очистки лимфы сорбцией заключается впропускании избранной среды через колонку, содержащую сорбент, где ипроисходит связывание последним патогенного агента, после чего очищеннаясреда возвращается в организм.Дляисследованиясорбцииготовилисуспензиюадсорбентоввфизиологическом растворе с концентрацией 12,0±1,0 мг/мл, которуюобрабатывали ультразвуком в течение 40 мин в ультразвуковой ванне(Elmasonic-S-100-H) на частоте 37 кГц для дезагрегации частиц и ихравномерного распределения по объему. Затем смешивали 0,5 мл каждойполученной суспензиис 3 мл плазмы лимфы. Полученную смесьвыдерживали при постоянном встряхивании в течение 3-х минут и послеэтого отделяли частицы центрифугированием при 2500-3000 об/мин в течение15 минут.
Содержание контролируемых ингредиентов в лимфе до и послесорбции определяли на лабораторных биохимических анализаторах Olympus(Германия), Advia 1200 (США - Германия) и системе клиническогокапиллярного электрофореза Paragon (США).Список образцов и способы их обработки представлены в таблице 4.5.136Таблица 4.5. Наименование и способ обработки образцов исходной лимфы№ НаименованиеМетод обработкиУсловие обработкиобразца1 ЛимфаИСХ2 Лимфа1ЦЦентрифугированиеFr 11300 (15000 об/мин), 10 мин3 Лимфа2Ц*ЦентрифугированиеFr 11300 (15000 об/мин), 10 мин4 Лимфа3ЦЦентрифугированиеFr 1500 (2500 об/мин), 40 мин5 Лимфа4ЦЦентрифугированиеFr 1600 (3000 об/мин), 30 мин6мембраны PELXL, размер пор ЛимфаМФМикрофильтрация0,22 μм, S фильтрации 50 см27ПредварительнаяЛимфаFe3O4/ГК Сорбция Fe3O4/ГКультразвуковая обработкаОбработкасуспензии8ЛимфаFe3O4/Pec Сорбция Fe3O4/Pecсорбентов, 3 мин сорбции*Лимфа2Ц представлены с учетом разбавленияРезультаты исследования процессов сорбции основных ингредиентовлимфы с использование нанокомпозитов приведены в таблице 4.6.
Числовыепоказатели соответствуют средней концентрации компонентов лимфыотносительно их количеств в исходном состоянии (до обработки сорбентом).Таблица 4.6. Концентрации компонентов лимфы до и после обработкисорбентамиКомпонентНаименование образцалимфыЛимфаFe O ГК [164]ЛимфаFe O PecЛимфаИСХALT, U/л16,08,010,0AST, U/л15,08,010,0BiliT, μМ2,82,82,8Chol, μМ1,720,971,03Creat, μМ57,529,034,0GLU, μМ34,8918,5321,95TP, г/л28,014,017,03 43 4Отметим, что исходные показатели содержания указанных в таблице 4.6ингредиентов в плазме лимфы до исследований не соответствовалинормальным показателям.137LFe3O4 / HAL Fe 3O 4 / PecРисунок 4.8. Диаграмма содержания компонентов в образцах лимфыЛимфаFe O / ГК и ЛимфаFe O / Pec3 43 4Как видно из представленных на рисунке 4.8 данных в относительныхединицах (%), введение сорбентов приводит к сорбции на их поверхностипрактически всех компонентов лимфы, за исключением билирубина (BiliT).
Вотличие от механических методов очистки использование наносорбентовпозволяет снизить концентрацию глюкозы. Содержание компонентов лимфыснизилось на 50 % и более по сравнению с исходным образцом, что указываетна эффективность используемых сорбентов. Следует отметить, что близкиезначения удельной поверхности нанокомпозитов - 64 м2/г для Fe3O4/ГК и 62м2/г для Fe3O4-Pec, а также средние размеры кристаллитов (~16 и ~14 нмсоответственно)отражаютсяинасорбционнойэффективностинанокомпозитов. Значения равновесной концентрации компонентов лимфыпосле сорбции на Fe3O4-ГК немного выше соответствующих значений длякомпозита на основе пектина Fe3O4-Pec10.Проведенные исследования по очистке биологических жидкостейорганизма, в частности лимфы, от токсических компонентов показали, чтоиспользование методов разделения, включая центрифугирование и микро- иультрафильтрацию, а также использование наносорбентов на основефункционализированных полимерами биосовместимых наночастиц магнетита138позволяет с различной степенью эффективности очищать лимфу от еекомпонентов, что позволяет использовать эти подходы в техническихсистемах для очищения жидких сред организма.4.3.
Противоопухолевые и хемисенсибилизирующие свойства пектиновыхпрепаратов 4.3.1. Характеристика экспериментальных животныхВ работах использованы 250 половозрелых белых крыс Вистар самцовмассой 110-195 г. Животных содержали в виварии РОНЦ РАН им. Н.Н.Блохина и Медицинской академии (КР). Во время экспериментальныхисследований животных содержали в соответствии с правилами, принятымиЕвропейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемыхдля экспериментальных и иных научных целей. Животные находились вотдельном помещении с контролируемой температурой 20–25 °С, влажностью- не более 50 %. Крыс помещали в специальные пластмассовые клетки состружечной подстилкой по 5-6 животных в каждой.
Все животныедополнительно получали овес, хлеб, свежие овощи и фрукты, мел. Приразделении животных на группы проводили их ранжирование по массе тела сцелью обеспечения идентичности по данному показателю. Статистическаяобработка результатов проведена непараметрическими методами [269]. 4.3.2. Характеристика опухолевых штаммов Штаммы перевиваемых опухолей - карциносаркомы Уокера W256(Walker, W256) и лимфосаркомы Плисса (Pliss) получены и привиты крысам влаборатории комбинированной терапии опухолей РОНЦ РАМН имени Н.Н.Блохина.1394.3.3. Терапия Уокера W256 пектином в дозе 45 мг/кгВ опыт взяты самки беспородных крыс весом 120 - 160 г.
Контрольнаягруппа состояла из 25 животных, опытная – из 15. Взвесь измельченнойопухолевой ткани объемом 0,2 мл в соотношении 1:2 со средой 199 вводили вмышцу бедра. Согласно существующего правила в экспериментальнойонкологии [211] лечение начинали через 72 часа после перевивки. Препаратвводили зондом per os 1 раз в сутки в дозе 45 и 400 мг/кг соответственно втечение 10 дней.В качестве критериев оценки противоопухолевого эффекта препаратоввыбраны торможение роста опухоли (Ki - параметр ингибирования) иувеличение продолжительности жизни (∆τ).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
