Диссертация: Молекулярно-генетические и иммунохимические методы в диагностике, индикации и идентификации возбудителей

Актуальность. Туберкулез и лейкоз крупного рогатого скота наиболее распространенные хронические инфекции в животноводстве и представляют собой важные проблемы не только ветеринарной медицины, животноводства, но биологии и экологии в целом и имеющие непосредственное отношение к безопасности здоровья человека. На современном этапе борьбы с туберкулёзом и лейкозом животных, основой профилактических и оздоровительных мероприятий была и остаётся своевременная и точная диагностика этих инфекций.
Огромный вклад в изучение эпизоотологии, диагностики и ликвидации туберкулеза сельскохозяйственных животных внесли такие ученые как М.Н.Верещагин (1926), П.П.Вишневский (1935), М.К.Юсковец (1963), О.В.Мартма (1971), В.П.Урбан (1980), М.А.Сафин (1980), Д.Д.Новак (1984), Н.М.Колычев (1992), А.С.Донченко (1993, 1995), В.Г.Ощепков (2001), Н.А.Донченко (2008), А.Х.Найманов (2009) и другие.
Диагноз на туберкулез ставят комплексным методом на основе эпизоотологических, клинических, аллергических, патологоанатомических и лабораторных исследований. Однако не возможно выделить какой-либо один метод диагностики туберкулеза, имеющий значительные преимущества перед другими, скорее они могут взаимодополнять друг друга и поэтому имеют право на существование (С.И.Татьков и др.,2006; В.А.Сазонов и др. 1996). По мнению А.М.Лысенко (1987), Е.В.Маслова (1986), Armbrust А. (1988) и др., для диагностики туберкулеза животных наиболее перспективен иммуноферментный анализ, который позволяет ставить диагноз на туберкулез в лабораторных условиях одновременно у большого количества животных, прост в применении и обладает высокой чувствительностью и специфичностью. В связи с этим, получение и изучение антигенных и иммуногенных характеристик микобактериальных антигенов, специфических антител, возможностей их использования для диагностики туберкулеза, дифференциации неспецифических реакций животных на туберкулин в иммунохимических реакциях являются актуальной задачей для ветеринарной практики в плане повышения эффективности диагностики, индикации и идентификации возбудителей туберкулеза крупного рогатого скота.
Определение современными методами уровня и спектра противотуберкулезных антител далеко не исчерпало себя в качестве средства иммунодиагностики и характеристики особенностей течения туберкулеза, а сами противотуберкулезные антитела не достаточно используются для характеристики микобактериальных антигенов, приготовления диагностикумов и других целей (Л.Н.Черноусова и др., 1995, 2000). Разработка экспресс-методов индикации и идентификации возбудителя туберкулеза из биоматериала животных и дифференциации патогенных микобактерий от атипичных остается актуальной задачей научных исследований (А.Н.Шаров и др., 2000, 2003; М.С.Калмыкова, 2007). Более преспективной в этом отношении, наряду с методами иммуноферментного анализа, является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В настоящее время, в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота и идентификации микобактерий, интенсивно разрабатываются различные подходы по применению ПЦР и других приемов генодиагностики (С.Н.Радюк, Г.Р.Мацевич, 1997; Е.Б.Вишневская, 1998; А.Н.Шаров, В.А.Седов, 1998; А.М.Алимов, 1999; А.Х.Найманов и др., 2004; Н.А.Донченко, 2008 и др.).
В структуре инфекционной патологии лейкоз крупного рогатого скота в РФ занимает лидирующее место и составляет более 50% от других нозологий (М.И.Гулюкин, 2003; А.М.Смирнов, 2005). Широкая распространенность лейкоза крупного рогатого скота, отсутствие средств терапии и специфической профилактики определяют актуальность научных исследований по этой проблеме (Г.А.Симонян, 1975; В.А.Бусол, 1983; М.И.Гулюкин, 2003; Л.Г.Бурба, А.Ф.Валихов, 1985; В.М.Нахамсон, 1986; П.Н.Смирнов, 1986; И.М.Донник, 1999; В.В.Храмцов, М.А.Амироков, 2005; А.М.Алимов, 2010).
Одним из приоритетных направлений исследований по изучению особенностей и закономерностей инфекционного процесса лейкоза крупного рогатого скота является разработка высокочувствительных методов прижизненной диагностики болезни (В.А.Бусол, 1997; Р.В; О.А.Верховский и др., 2002; М.И.Гулюкин, В.А.Храмцов, А.С, Донченко и др., 2002; В.И.Околелов и др., 2003; П.Н.Смирнов, 2008; М.И.Гулюкин, 2008; И.М.Донник и др., 2009).
В настоящее время, согласно стандартам МЭБ, узаконенными методами диагностики лейкоза крупного рогатого скота являются реакция иммунодиффузии в геле агара и метод иммуноферментного анализа.
Важным преимуществом иммуноферментных методов, наряду с более высокой чувствительностью и специфичностью, является то, что ИФА позволяет выявлять специфические антитела в пробах сборного молока. Если учесть доступность и простоту выполнения, то ИФА для выявления специфических антител в пробах молока может стать важнейшим элементом в системе противолейкозных мероприятий в хозяйствах (Nguyen V.K., Maes R.F., 1992; Sargeant J.M., Kelton D.F et al., 1997).
Весьма актуальной задачей является изучение иммунологических аспектов патогенеза лейкоза крупного рогатого скота. Определение динамики образования и спектра антител, идентификация и изучение состава иммунных комплексов способствуют расшифровке молекулярно-клеточных механизмов взаимодействия вируса лейкоза с макроорганизмом и объяснению особенностей патогенеза.
Результаты подобных исследований явятся основой для разработки новых высокоспецифичных и ранних методов выявления инфицированности животных возбудителями туберкулеза и лейкоза, а также для создания более надежной системы мер борьбы с этими опасными инфекционными болезнями.
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось усовершенствование иммунохимических и молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота, а также средств индикации и идентификации возбудителей этих инфекций. В соответствии с целью решались следующие задачи:
- изучить антигенную структуру микобактерий и усовершенствовать способы получения антигенных препаратов;
- изыскать способы получения высокоспецифичных антигенов микобактерий и антител, обеспечивающих индикацию и идентификацию микобактерий в патологическом материале, и дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин методом ИФА;
- определить эффективность иммуноферментного анализа для выявления специфических антител при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;
- определить диагностическую ценность ИФА и ПЦР в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;
- изучить динамику образования специфических антител и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота;
- разработать ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке, и определить его диагностическую ценность;
- изучить динамики антителогенеза у крупного рогатого скота к различным структурным компонентам вируса лейкоза;
Научная новизна. Иммунохимическими и биохимическими методами изучена антигенная структура микобактерий и разработаны способы получения высокоспецифичных антигенов из инактивированных культур и антител к ним, обеспечивающих индикацию и идентификацию микобактерий в патологическом материале, дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин. Установлено, что особенности антителогенеза, диссоциация циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке, обнаружение провирусной ДНК в их составе являются важными факторами повышения эффективности диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
Впервые разработан способ получения антигенов микобактерий, обеспечивающих дифференциальную диагностику туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа («Способ получения антигена для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота» – положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение от 12.08.2010г., заявка №2009112145).
Показана высокая информативность разработанного ИФА для выяснения эпизоотической ситуации хозяйств по туберкулезу крупного рогатого скота.
Разработана технология повышения специфичности иммунных сывороток к микобактериальным антигенам, обеспечивающая индикацию и дифференциацию микобактерий в патологическом материале методом иммуноферментного анализа («Белково-глутаральдегидный метод очистки иммунной сыворотки против M.bovis» – рационализаторское предложение №314-91 от 5.03.1991).
Разработан ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке с предварительной диссоциацией циркулирующих иммунных комплексов в пробах («Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота» – заявка на патент РФ №2010100016, приоритетная справка от 11.02.2010г.) и определена его диагностическая ценность. Установлено, что иммуноферментный анализ с предварительной диссоциацией иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке увеличивает выявляемость инфицированных ВЛКРС животных на 20%.
Впервые изучена динамика образования и спектр свободных антител и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке коров инфицированных ВЛКРС в естественных условиях. Установлено, что при уменьшении титров свободных антител в сыворотке крови повышается уровень циркулирующих иммунных комплексов. На разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр антител меняется. Данные факты свидетельствует о том, что разовые серологические тесты, основанные на выявление антител против только одного антигена, в диагностике лейкоза могут быть не эффективными.
Впервые методом полимеразной цепной реакции доказано присутствие в составе циркулирующих иммунных комплексов провирусной ДНК ВЛКРС, что расширяет представления о патогенезе инфекции и способствует дальнейшему совершенствованию методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
Практическая значимость работы. Разработанный способ выделения специфических микобактериальных антигенов повышает эффективность прижизненной дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота иммунологическими методами.
«Набор препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА» и «Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий в патологическом материале» позволяют выяснить эпизоотическую ситуацию по туберкулезу в хозяйствах, и рекомендуются для включения в комплексную систему мероприятий по борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота.
Разработанный иммуноблот анализ микобактериальных антигенов позволяет идентифицировать микобактерии и может быть использован в качестве дополнительного теста для диагностики туберкулеза.
Для повышения выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота целесообразно проводить ИФА с предварительной диссоциацией циркулирующих иммунных комплексов. Разработанный метод ИФА с предварительной диссоциацией ЦИК в исследуемых пробах открывает широкие перспективы для диагностики данной инфекции методом иммуноферментного анализа молока.
Результаты научных исследований успешно апробированы и внедрены в хозяйствах Буинского, Дрожжановского, Зеленодольского, Черемшанского, Тюлячинского, Нижнекамского, Высокогорского, Арского и др. районов РТ. По результатам исследований подготовлены методические рекомендации, направленные на усовершенствование методов диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные НТС КГАВМ, ГУВ КМ РТ:
«Тест-система иммуноферментная для выявления специфических антител против микобактерий» - утверждены НТС КВИ, протокол №5 от 22.05.92г.
«Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий» - утверждены НТС КВИ, протокол №5 от 22.05.92г.
Методические рекомендации по диагностике лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа сыворотки крови и молока, утвержденные НТС ГУВ КМ РТ, протокол №1 от 21.01.2008г.
Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, утвержденные НТС ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол № 2 от 4.06.2009. и НТС ГУВ КМ РТ, протокол № 3 от 8.10.2010г.
Методические рекомендации по применению микобактериальных антигенов в ИФА для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота, утвержденные НТС ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол № 5 от 15.12.10г. и НТС ГУВ КМ РТ, протокол № 4 от 20.12.2010г.
Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа и по применению микобактериальных антигенов в ИФА для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота представлены в Федеральную службу по ветеринарному и фитосанитарному надзору МСХ РФ для утверждения в установленном порядке.
Апрбация работы. Результаты диссертационной работы доложены и одобрены на республиканских и Всероссийских научно-производственных конференциях по актуальным проблемам агропромышленного комплекса (Казань, 1989, 1990, 1991, 1993, 1999, 2004, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010); Всесоюзной научно-технической конференции «Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине» (Н.Новгород, 1990); межвузовской научно-производственной конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых и специалистов в научно-технический прогресс с/х производства» (Ставрополь, 1991); международной научной конференции посвященной 125-летию КГАВМ (Казань, 1998); международной научной конференции «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе» (Москва, 1999); международной научно-производственной конференции посвященной 100-летию членкора ВАСХНИИЛ В.Т.Котова (Воронеж, 1999); республиканских научно-производственных конференциях молодых ученых и специалистов (Казань, 1998, 2000); международной научной конференции посвященной 70-летию зооинженерного факультета КГАВМ (Казань, 2000); международной научной конференции «Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки» (Троицк, 2000); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007); Международной научно-производственной конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (Москва, 2008); II-м съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997); IV-м съезде Российского общества биохимии и молекулярной биологии (Новосибирск, 2008). Международной научно-практической конференции посвященной 90-летию кафедры биологической и органической химии СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2009).
Публикация результатов исследований. Основные результаты исследований, выполненные по теме диссертации, опубликованы в 42 печатных работах, в том числе в 10 изданиях, рекомендованных ВАК, таких как «Ветеринарный врач», «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии», «Ученые записки КГАВМ».
Основные положения, выносимые на защиту:
- изучением антигенной структуры микобактерий получены высокоспецифичные антигены и антитела для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.
- полимеразная цепная реакция и иммуноферментный анализ на основе очищенных антигенов и антител повышают эффективность диагностики туберкулеза и лейкоза, обеспечивают дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота, а также индикацию и типизацию микобактерий в патологическом материале.
- инфекционный процесс при лейкозе крупного рогатого скота сопровождается синтезом антител к различным компонентам вируса, уровень которых варьирует в зависимости от стадии болезни.
- диссоциация циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке, обнаружение провирусной ДНК в их составе повышают эффективность диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 296 страницах стандартного компьютерного набора, содержит 41 таблицу и 23 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, заключения и выводов, предложений производству, списка литературы и приложений.
Библиографический список использованной литературы включает 394 источников, в том числе 180 на иностранных языках. Прилагаются акты производственных и комиссионных испытаний, акты внедрения, патенты на изобретение, методические рекомендации и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.
Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: д.б.н. В.П.Коксин, к.б.н. К.С.Хаертдинов, к.в.н. Усольцев, к.б.н. Зиннатов Ф.Ф.
Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи научному консультанту д.в.н., профессору А.М.Алимову, д.в.н., профессору кафедры биохимии КГАВМ Н.З.Хазипову, ректору ФГОУ ВПО КГАВМ, д.в.н., профессору Г.Ф.Кабирову.