ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ
ПРОЦЕССЫ.
ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ УРОВНИ
АТОМОВ И МОЛЕКУЛ.
ПОГЛОЩЕНИЕ СВЕТА
ВЕЩЕСТВОМ.
Классификация фотобиологических процессов
Энергетические уровни атомов и молекул
Спектры поглощения биомакромолекул
Закон Бугера – Ламберта – Бера
Спектроскопические методы исследования
ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ
ПРОЦЕССЫ
И ИХ КЛАССИФИКАЦИЯ
Фотобиологическим называют процесс, который
начинается с поглощения квантов света молекулами
и заканчивается физиологической реакцией
организма
С ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ ТОЧКИ ЗРЕНИЯ
1. ЭНДЭРГОНИЧЕСКИЕ
2. ЭКЗЭРГОНИЧЕСКИЕ
С БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТОЧКИ ЗРЕНИЯ
1. СОБСТВЕННО ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ
А) ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ
В) БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ
Б) ИНФОРМАЦИОННЫЕ
2. ДЕСТРУКТИВНО-МОДИФИЦИРУЮЩИЕ
А) ЛЕТАЛЬНЫЕ;
Б) МУТАЦИОННЫЕ;
КАНЦЕРОГЕННЫЕ
В) ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ
Эритема (стойкое воспалительное
покраснение кожи, возникающее
вследствие расширения
кровеносных сосудов)
Стадии фотобиологического процесса:
поглощение кванта света;
внутримолекулярные процессы размена энергией
(фотофизические процессы);
межмолекулярные процессы переноса энергии
возбужденного состояния;
первичный фотохимический акт;
темновые реакции, заканчивающиеся образованием
стабильных продуктов;
биохимические реакции с участием фотопродуктов;
общефизиологический ответ на действие света.
Все виды электромагнитного излучения ( от коротковолновых
рентгеновских лучей до радиоволн) представляют собой
различные формы одного и того же явления, различающиеся
только длиной волны и энергией фотона.
Воздействие света разных длин волн вызывает разные
фотобиологические эффекты:
Ультрафиолет
Эритема
загар
рак кожи
иммуносупрессия
Видимый свет
Инфракрасное
излучение
Зрение
фототропизм
фототаксис
фотопериодизм
Тепловое
излучение
Терапевтические
эффекты
красного света
КОРПУСКУЛЯРНО-ВОЛНОВОЙ
ДУАЛИЗМ СВЕТА
Квант одновременно
частица и волна
Свет - совокупность одного
или нескольких фотонов,
распространяющихся в
пространстве в виде
электромагнитных волн.
Пары фотонов с частотой около 1 ГГц.
волновые явления
квантовые явления
интерференция
фотоэффект
дифракция
давление света
поляризация
линейчатость спектров
испускания и поглощения
МОДЕЛЬ АТОМА
Нильс Бор
(1885-1962)
Нобелевская премия, 1922
Н.БОРА
Первый постулат Бора (постулат
стационарных состояний):
атомная система может находится только
в особых стационарных или квантовых
состояниях, каждому из которых
соответствует определенная энергия En.
В стационарных состояниях атом не
излучает.
Энергетические уровни атома и условное
изображение процессов поглощения и испускания
фотонов
Второй постулат Бора (правило частот) : при
переходе атома из одного стационарного
состояния с энергией En в другое стационарное
состояние с энергией Em излучается или
поглощается квант, энергия которого равна
разности энергий стационарных состояний
hνnm = En – Em
Нобелевская премия по
физике, 1929 г.
Луи ДЕ БРОЙЛЬ
1892 –1987
Выдвинул гипотезу об универсальности
корпускулярно-волнового дуализма.
Он утверждал, что не только фотоны, но и электроны и
любые другие частицы материи наряду с
корпускулярными обладают также волновыми
свойствами.
ФОТОН как ЧАСТИЦА ОБЛАДАЕТ
ЭНЕРГИЕЙ
E = mc2 = h = hc / λ,
Где m - масса фотона, с - скорость света в вакууме, h постоянная Планка,
волны
- частота излучения, λ - длина
ИМПУЛЬСОМ
p=h /c=h/ λ
ВОЛНОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ: ЧАСТОТА, ФАЗА,
ДЛИНА ВОЛНЫ
По аналогии с соотношением между длиной волны
света и энергией фотона де Бройль высказал гипотезу о
существовании соотношения между длиной волны и
импульсом частицы (массы, умноженной на скорость
частицы).
ФОРМУЛА де БРОЙЛЯ:
λ = h / mv,
m - масса частицы, v - ее скорость, h постоянная Планка
ГДЕ
ДЛЯ ОПИСАНИЯ СОСТОЯНИЯ
ЭЛЕКТРОНА В АТОМЕ ВОДОРОДА В
1926 году ПРЕДЛОЖЕНО УРАВНЕНИЕ
ШРЕДИНГЕРА
Уравнение Э.Шредингера содержит волновую функцию
и позволяет определить возможные состояния квантовой
системы и их изменение во времени.
ψ - волновая функция характеризует движение электрона
в пространстве как волнообразное возмущение; x, y, z координаты, m - масса покоя электрона, h - постоянная
Планка, E - полная энергия электрона, Ep - потенциальная
энергия электрона
В ходе решения волнового уравнения вводятся
целые числа - так называемые квантовые числа,
которые служат для описания состояний квантовохимической системы.
Главное квантовое число
n
Орбитальное квантовое
число
l
Магнитное квантовое
число
ml
Спиновое квантовое
число
ms
Принцип минимума энергии
Электроны занимают в первую очередь орбитали,
имеющие наименьшую энергию.
Принцип Паули
ограничивает число электронов, которые могут
находиться на одной орбитали.
На любой орбитали может находиться не более
двух электронов и то лишь в том случае, если они
имеют противоположные спины (неодинаковые
спиновые числа). Поэтому в атоме не должно быть
двух электронов с одинаковыми четырьмя
квантовыми числами (n, l, ml, ms).
КВАНТОВОМЕХАНИЧЕСКАЯ ТЕОРИЯ
СТРОЕНИЯ АТОМА
Система микрочастиц, не подчиняющаяся
законам классической механики
Стационарные орбиты электрона – это орбиты,
находясь на которых, электрон не излучает энергию
Излучение энергии происходит при переходе
электрона с одной орбиты на другую
Квантование энергии электрона
Двойственная природа электрона
ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ УРОВНИ
АТОМОВ И МОЛЕКУЛ
S(электроны
спаренные)
СИНГЛЕТНЫЕ УРОВНИ
S1 и S2 - возбужденные
синглетные уровни
Е
S2
S1
SO –основной
синглетный уровень
СИНГЛЕТНЫЕ S и ТРИПЛЕТНЫЕ
(электроны не спаренные) УРОВНИ
Т
Е
S2
S1
Т
SO
ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ УРОВНИ МОЛЕКУЛ
Еэл
Екол
Екол
Евращ
Еэл — энергия движения электронов относительно ядер,
Екол — энергия колебаний ядер (в результате которых
периодически изменяется относительное положение
ядер),
Евращ — энергия вращения ядер (в результате которых
периодически изменяется ориентация молекулы в
пространстве).
Пьер Бугер
(Буге)
(1698-1758)
ЗАКОН
БУГЕРА – ЛАМБЕРТА –
БЕРА
Иоганн Генрих Ламберт
1728-1777
I0 – ИНТЕНСИВНОСТЬ ПАДАЮЩЕГО СВЕТА
I1 – ИНТЕНСИВНОСТЬ ВЫШЕДШЕГО СВЕТА
l – ТОЛЩИНА КЮВЕТЫ (ДЛИНА ОПТИЧЕСКОГО ПУТИ)
с – КОНЦЕНТРАЦИЯ РАСТВОРА В КЮВЕТЕ
dI kIcdl
dI
kcdl
I
ln I kcl C
При начальных условиях l =0 и С=lnI 0
ln I kcl ln I 0
I
ln kcl
Io
В экспоненциальной форме
Отсюда
kcl
I I 0 e
I
kcl
e
I0
ЗАКОН БУГЕРА – ЛАМБЕРТА – БЕРА
ИНТЕНСИВНОСТЬ СВЕТА, ПРОШЕДШЕГО ЧЕРЕЗ
ОБРАЗЕЦ, ЭКСПОНЕНЦИАЛЬНО УМЕНЬШАЕТСЯ В
ЗАВИСИМОСТИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ РАСТВОРА И
ДЛИНЫ ОПТИЧЕСКОГО ПУТИ
Перепишем уравнение еще раз в логарифмической
форме и избавимся от минуса
ln
I0
I
k c l
Заменим натуральные логарифмы десятичными и
получим
D lg
I0
I
c l
D- оптическая плотность, - молярный коэффициент
поглощения, с – концентрация раствора, l – длина
оптического пути
ЗАВИСИМОСТЬ ОПТИЧЕСКОЙ
ПЛОТНОСТИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ
РАСТВОРА
tg = l
УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ЗАКОНА
БУГЕРА – ЛАМБЕРТА - БЕРА
1. Свет монохроматический
2. Отсутствие взаимодействия между
светопоглощающими центрами
3. Хаотическое расположение светопоглощающих
центров
Иногда используют другую характеристику КОЭФФИЦИЕНТ ПРОПУСКАНИЯ
I
T 100%
I0
Т
ОПТИЧЕСКАЯ ПЛОТНОСТЬ И КОЭФФИЦИЕНТ
ПРОПУСКАНИЯ СВЯЗАНЫ ОТНОШЕНИЕМ:
I0
1
D lg lg lg T
I
T
ИЛИ
T 10
D
АБСОРБЦИОННАЯ И
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ
СПЕКТРОСКОПИЯ
БЕЛКОВ
ШКАЛА
ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ
КОЛЕБАНИЙ
ЛИНЕЙЧАТЫЕ СПЕКТРЫ АТОМОВ
СПЕКТР ПОГЛОЩЕНИЯ
БАКТЕРИОРОДОПСИНА
СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ
БЕЛКОВ
СПЕКТРОФОТОМЕТР - прибор, который измеряет
спектры поглощения
В ОСНОВЕ АБСОРБЦИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
ЛЕЖИТ ЗАКОН БУГЕРА – ЛАМБЕРТА - БЕРА
D lg
I0
I
c l
Особенности спектроскопии
биополимеров
Использование растворов
Узость температурного интервала, в котором
биополимеры не
денатурируют
ПОГЛОЩЕНИЕ БЕЛКОВ
Хромофор - функциональная группа, с которой
связано возбуждение молекулы посредством
поглощения света в видимой и ближней УФобласти.
Хромофоры белковых молекул
пептидные группы
простетические группы
боковые группы
аминокислотных
остатков
ПОГЛОЩЕНИЕ ПЕПТИДНЫХ ГРУПП
Для изучения свойств пептидных
хромофоров используют модельные соединения
(они аналогичны рассматриваемым соединениям в
отношении всей структуры или какого-то фрагмента
структуры)
формамид N -метил ацетамид
Пептидная группа
Поглощение наблюдается в диапазоне 210 – 220 нм
ПОГЛОЩЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ
ОСТАТКОВ
Для боковых групп многих аминокислот (Asp, Glu, Asn,
Gln, Arg и His) зарегистрировать электронные переходы в
белках или полипептидах практически нельзя.
ПРИЧИНЫ
Эти электронные переходы маскируются интенсивным
поглощением пептидной группы.
Они уступают по интенсивности электронному переходу
пептидной группы
Число соответствующих боковых радикалов обычно
меньше, чем число пептидных групп.
Интерес представляют только те хромофоры белковых
молекул, которые поглощают при длинах волн больше
230 нм, где вклад в поглощение пептидных групп
пренебрежимо мал.
Такими свойствами обладают Phe, Туг и Тгр, а также
гистидиновый фрагмент и дисульфидный мостик цистина.
Ароматические аминокислоты: триптофан, тирозин и
фенилаланин.
хромофорные группы этих аминокислот
бензольное
кольцо
фенилаланин
фенольное
кольцо
тирозин
Индольное
кольцо
триптофан
Спектры поглощения ароматических аминокислот.
По оси ординат отложены значения молярного
коэффициента экстинкции в логарифмической шкале
Изменение рН мало влияет на спектры поглощения
изолированных пептидных хромофоров.
В противоположность этому тирозин и триптофан весьма
чувствительны к рН.
Спектрофотометрическо
е титрование
панкреатической РНКазы
быка (содержит 6
тирозиновых остатков).
А. Изменение спектра
поглощения с изменением
рН и со временем (при рН
12,2). При меньших
значениях рН зависимость
от времени отсутствует.
Б. Зависимость
коэффициента экстинкции
при 295 нм от рН.
А
Б
Многие белки содержат группы, отличающиеся от
обычных аминокислот.
ПРИМЕРЫ
ГЕМПРОТЕИНЫ
РОДОПСИН
ФЛАВОПРОТЕИНЫ
Очищенный родопсин был
измерен дважды: сначала он
был
выделен
из
адаптированной к темноте
коровьей сетчатки (сплошная
кривая) и затем снова выделен
из
сетчатки
после
ее
освещения
(пунктирная
кривая). (From M.L. Applebury, DM.
Zuckerman, A.A. Lamola, and T.M. Jovin,
1974, Biochemistry 13 : 3448. Copyright
by the American Chemical Society
Спектр поглощения коровьего родопсина в УФ и видимой
областях.
Зеленый
хлорофилл
Оранжевый
каротин
Красный
оксигемоглобин
Спектры поглощения
некоторых
хромофорных белков
Спектры поглощения цитохрома с (Fe3+) при различных
значениях рН 1.7 – 6.8
Дифференциальный спектр – разностный
спектр, который получается при автоматическом
вычитании из спектра поглощения вещества в
измеряемой кювете спектра поглощения вещества в
кювете сравнения.
D ( )
Спектр в кювете сравнения
D( )
Спектр в измеряемой кювете
Дифференциальный спектр:
D( ) D( ) D( )
Если разложить это в степенной ряд по малому
параметру и пренебречь членами второго
порядка малости, тогда дифференциальный спектр
будет
D
D( )
В первом приближении дифференциальный спектр
поглощения соответствует первой производной
от спектра поглощения
D
СПЕКТР ПОГЛОЩЕНИЯ ТРИПТОФАНА В ВОДЕ
МАКСИМУМ ПРИ
280 нм И МАЛЕНЬКИЙ ПИК ПРИ 288 нм
СПЕКТР ПОГЛОЩЕНИЯ (а) и ТЕМПЕРАТУРНО-ПЕРТУРБАЦИОННЫЙ
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ СПЕКТР (б) ТРИПТОФАНА В ВОДЕ
Градиент температуры 10о, D – дифференциальная оптическая
плотность
Для получения ТЕМПЕРАТУРНО-ПЕРТУРБАЦИОННЫХ
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫХ СПЕКТРОВ раствор белка одинаковой
концентрации помещают в кюветы, в которых создают разность
температур.
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ СПЕКТР ИМЕЕТ НЕСКОЛЬКО УЗКИХ
МАКСИМУМОВ
СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ БЕЛКОВ МАЛО ОТЛИЧАЮТСЯ ДРУГ ОТ
ДРУГА, ТОГДА КАК ТЕМПЕРАТУРНО-ПЕРТУРБАЦИОННЫЕ
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ СПЕКТРЫ СУЩЕСТВЕННО РАЗЛИЧНЫ
Методы АБСОРБЦИОННОЙ и ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ
СПЕКТРОСКОПИИ
широко
используются
для
определения и изучения
•констант скорости ассоциации субъединиц в белках
•конформационных изменений в белках
• процессов денатурации и ренатурации белков
