Микроскопические
методы.
Оптические методы.
Микроскопия
представляет
собой
совокупность
методов
визуализации
и
диагностики широкого класса объектов с
помощью различных физических инструментов.
Оптическая микроскопия - в качестве
инструмента используются электромагнитные
волны (фотоны)
Оптическая микроскопия
Разрешение оптической микроскопии
Дифракционный предел Аббе
Дифракционные пятна и их профили
интенсивности. Слева – разрешенные точки.
Справа – точки будут разрешены, если
провал
(а)
между
профилями
интенсивности меньше 26% от максимума.
Разрешение оптической микроскопии
Дифракционный предел Аббе
Эрик Бетциг (США),
Уильяму Мернер (США) и
Штефан Хелль (Германия)
Нобелевская премия по химии
2014 года за развитие
флуоресцентной микроскопии
со сверхвысоким разрешением
Оптическая микроскопия дальнего поля
≥200 нм
≥50 нм
≥100 нм
≥20 нм
Оптическая микроскопия дальнего поля
Флуоресцентная микроскопия
Флуоресценция
обуславливается
строением
энергетических уровней электронов молекулы и
поэтому является специфическим, для каждого типа
молекулы, свойством .
«-»
При
попытке
исследования
препарата,
обладающего известной толщиной, изображение теряет
контраст и становится размытым.
Конфокальная микроскопия
Для ликвидации паразитного сигнала из участков вне
плоскости фокуса использовалась диафрагма с
отверстием малого размера, расположенная в
плоскости, сопряженной с плоскостью фокуса
объектива таким образом, что если диафрагму
спроецировать на объект, то ее изображение точно
совпадает с фокусом освещающего объект света
(«конфокальный» - основанный на сопряжении
фокусов). Свет из областей вне фокуса задерживается
диафрагмой, а на детектор попадаает только сигнал из
фокуса объектива
Оптическая микроскопия дальнего поля
Мультифотонная микроскопия
Флуорофоры
исследуемого
объекта
переводятся в возбужденное состояние двумя
или тремя длинноволновыми фотонами, что
эквивалентно
возбуждению
одним
коротковолновым фотоном. Мультифотонная
микроскопия
не
требует
наличия
конфокальной микродиафрагмы, так как ее
флуоресценция возникает строго в фокальной
плоскости.
Оптическая микроскопия дальнего поля
Микроскопия на основе подавления спонтанного испускания
STED (Stimulated Emisssis>n Dsepleti>n Mtiscr>sc>py, Шt.Хелль )
Молекулы красителя сначала возбуждают
лазерным пятном минимально возможного
размера. А потом на краях этого пятна
возбуждение молекул еще и специально
тушат, заставляя их испустить фотон с
помощью дополнительного импульса лазера
кольцевой формы, который настроен на
длину волны люминесценции. И лишь после
этих двух импульсов регистрируют свечение
возбужденных молекул, оставшихся в центре
пятна.
.
где Imax — применяемая интенсивность
STED-лазера, Isat — интенсивность,
которая необходима для 50% вынужденной
эмиссии.
Оптическая микроскопия дальнего поля
Микроскопия на основе подавления спонтанного испускания
STED (Stimulated Emisssis>n Dsepleti>n Mtiscr>sc>py, Шt.Хелль )
Оптическая микроскопия дальнего поля
Методы одномолекулярной флуоресцентной микроскопии
(sisngle-m>lecule fu>rescence miscr>sc>py )
Метод фотоактивируемой локализационной микроскопи
(PhotoActvated Localizaton Microscopy, PALM), Э.Бетциг
Метод 3D стохастической оптической реконструкционной микроскопии
(Stochastc Optcal Reconstructon Microscopy, STORM)
Метод
STORMt
использует
последовательное
возбуждение
молекул
флуорофоров,
чтобы
каждая
молекула
была
представлена в качестве одного
дифракционного
пятна.
Это
возможно
при
использовании
возбуждающего излучения малой
мощности, возбуждающего лишь
малую часть присутствующих в
объекте флуорофоров.
Оптическая микроскопия дальнего поля
Методы одномолекулярной флуоресцентной микроскопии
(sisngle-m>lecule fu>rescence miscr>sc>py )
Оптическая микроскопия дальнего поля
Микроскопия насыщенного структурированного освещения
SR-SIM (Super Res>luti>n Structured Illumisnati>n Mtiscr>sc>py).
В плоскости,
сопряженной
с фокальной, располагается
решетка,
создающая
определенный
паттерн
освещения.
Индуцируемая
флуоресценция
повторяет
паттерн освещения, при этом
флуоресценция
объектов,
расположенных в фокальной
плоскости, сильно меняется
при
перемещении
этого
паттерна.
Флуоресценция
объектов,
расположенных
не в фокусе,
от сдвига
решетки
практически
не зависит.
Последующая
компьютерная
обработка
позволяет
отсечь
флуоресценцию от остальных
оптических слоев и также
улучшить разрешение.
Оптическая микроскопия дальнего поля
Микроскопия насыщенного структурированного освещения
SR-SIM (Super Res>luti>n Structured Illumisnati>n Mtiscr>sc>py).
На трех исходных изображениях (A—C) видно, что при перемещении решетки
(обозначено черной линией) интенсивность флуоресценции объектов,
расположенных в фокусе, заметно меняется. Флуоресценция, исходящая
от других оптических слоев, практически не меняется (обозначено белой
стрелкой), что позволяет избавиться от нее за счет компьютерной обработки (Ds).
Оптическая микроскопия дальнего поля
Микроскопия насыщенного структурированного освещения
SR-SIM (Super Res>luti>n Structured Illumisnati>n Mtiscr>sc>py).
Оптическая микроскопия ближнего поля
Оптическая микроскопия ближнего поля
d<<λ, h<< λ
Лазерное излучение направляется в кварцевую
иглу с металлизированным покрытием, конец
которой по диаметру меньше длины волны. На
конце иглы наводится поляризация, являющаяся
источником переменного электромагнитного поля
вне иглы, которое представляет суперпозицию
электрических и магнитных полей.
Самым
сильным
из
них
является
переменное
электрическое
поле
наведенного
диполя,
спадающее с расстоянием от кончика иглы r как
1/r3. Молекулы, расположенные вблизи иглы в
ближней зоне, возбуждаются этим полем сильнее,
чем молекулы расположенные на периферии.
Возбужденные молекулы из ближней зоны
флуоресцируютс наибольшей интенсивностью.
Коэффициент поглощения
света молекулой
K = f (E2)
E = E F + EN
Оптическая микроскопия ближнего поля
УНТ
Конфокальная микроскопия
Ближнепольная микроскопия
Оптическая микроскопия ближнего поля.
Плазмонная микроскопия высокого разрешения
