Диссертация (Анализ экспрессии и функциональной активности Toll-подобных рецепторов у больных бронхиальной астмой), страница 9

Исследование одобрено Локальным ЭтическимКомитетом ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.502.2 Разработка дизайна исследованияНа кафедре иммунологии медико-биологического факультета ФГБОУ ВОРНИМУ им. Н.И. Пирогова ведутся исследования роли TLR при различныхиммуноопосредованныхфункциональнойзаболеваниях.активностиTLRБылпоразработанметодиндуцированнойоценкилигандамисоответствующих рецепторов выработке TNFα МНК периферической крови [2].Для оценки вклада TLR в иммунопатогенез бронхиальной астмы исследованиепроводилось на трех группах больных контролируемой БА:I группа – больные аллергической БА (АБА) легкого и среднетяжелоготечения заболевания;II группа - больные смешанной БА (СБА) среднетяжелого течениязаболевания;III группа - больные неаллергической БА (НБА) среднетяжелого течениязаболевания.Согласно литературе, TLR2 и TLR4 в наибольшей степени вовлечены впатогенез бронхиальной астмы [14], однако данные носят противоречивый иразрозненный характер [23, 36].

TLR экспрессируются на большинстве клетокврожденного иммунитета, осуществляющих «первую линию» защиты отпатогенов [173]. У данных рецепторов наиболее широкий спектр лигандов,включая аллергены (например, аллерген клещей домашней пыли, Der p) [207,213].Для оценки вклада TLR2 и TLR4 в иммунопатогенез бронхиальной астмыбыл разработан дизайн эксперимента (рис. 6), включающий три основных этапа.На первом этапе работы изучалась экспрессия генов TLR2 и TLR4 вмононуклеарных клетках методом ПЦР-РВ.На втором этапе оценивалась экспрессия выбранных рецепторов на CD14 +моноцитах.

Определялся процент CD14+ моноцитов, экспрессирующих TLR2или TLR4, а также средняя интенсивность флюоресценции (СИФ) данных51рецепторовнавыбраннойпопуляцииклетокметодомпроточнойцитофлюорометрии.На третьем этапе оценивалась функциональная активность TLR2 и TLR4по лиганд-индуцированной продукции TNFα МНК периферической крови.Для этой цели МНК у больных БА и здоровых доноров стимулировалиагонистами TLR2 и TLR4, пептидогликаном, липополисахаридом и Der p,соответственно. Пептидогликан – это основной компонент клеточной стенкиграмположительных бактерий, а липополисахарид - это важный компонентклеточной стенки грамотрицательных бактерий.

Der p - аллерген клещейдомашней пыли, обладающий мимикрией к молекуле MD2. Выбранные длястимуляции TLR2 и TLR4 лиганды наиболее показательны, являютсяключевыми лигандами соответствующих TLR, повсеместно встречаются вокружающей среде.Также изучалась спонтанная и TLR2-, TLR4-индуцированная продукцияпро- и противовоспалительных цитокинов (IL-18, IL-33, IL-10, IL-4, IL-13)мононуклеарными клетками здоровых доноров и больных бронхиальной астмой.Данный подход позволил расширить наши представления о ролимеханизмов врожденного иммунитета в иммунопатогенезе контролируемойбронхиальной астмы разных форм легкого и среднетяжелого течения.52Рисунок 6.

Дизайн эксперимента532.3. Реактивы1. Среда RPMI 1640 (HyClone, U.S.)2. L-глутамин (НПП «ПанЭко», Россия)3. Эмбриональная телячья сыворотка (Sigma, США)4. Гентамицина сульфат (ОАО «Дальхимфарм», г. Хабаровск)5. Пептидогликан; Staphylococcus aureus (InvivoGen, США)6. Липополисахарид; E.сoli 0111:B4 (Sigma, США)7. Аллерген из клеща Dermatophagoides pteronissinus для диагностики и лечения(«Биомед им. Н.И.

Мечникова», Россия)8. Наборы для иммуноферментного анализа (e-Biosciences, США)9. Лизирующий раствор IOTest 3 LysingSolution (BeckmanCoulter, США)10. Моноклональные антитела к CD45, конъюгированные с флуоресцентнойметкой с ECD, («e-Biosciences», США)11.Моноклональные антитела к CD14, конъюгированные с флуоресцентнойметкой APC («e-Biosciences», США)12.МоноклональныеантителакCD284(TLR4),конъюгированныесфлуоресцентной меткой Alexa Flour 488, («e-Biosciences», США)13.Мышиный IgGA2, меченный Alex Flour 488 (Изотипический контроль), («eBiosciences», США)14.Раствор Хенкса (НПП «ПанЭко», Россия)15.Раствор для стабилизации РНК ―RNAlater RNA stabilization reagent‖,(QIAGEN)16.Набор для выделения РНК RNAprotect Cell Reagent (QIAGEN)17.Набор для проведения реакции обратной транскрипции (Синтол, РФ)18.Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии «SYBR Green I» ипраймеров (Синтол, РФ).542.4.

Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитовметодом проточной цитофлюориметрииИзучение экспрессии TLR2 и TLR4 на CD14+ моноцитах периферическойкрови проводили методом проточной цитофлюорометрии. Для этого 100 мклцельной крови инкубировали в течение 10 минут с мечеными моноклональнымиантителами (МАТ), затем осуществляли лизис эритроцитов с помощьюлизирующего раствора IOTest 3 Lysing Solution (Beckman Coulter, США), послечего клетки дважды отмывали при 1000 об/мин в растворе Хенкса. Анализобразцов проводили на проточном цитофлюориметре Beckman Coulter «Navios»(Beckman Coulter, Inc. США). В каждом образце было проанализировано не менее100000событий.Дляидентификацииклетокиспользовалиследующиемоноклональные антитела: анти-CD14, меченые APC («e-Bioscience»), анти-CD45,меченые ECD («e-Bioscience»), анти-СD282 (TLR2) и анти-CD284 (TLR4),меченые Alexa Fluor 488 («e-Bioscience»), изотипический контроль Mouse IgG2a,меченые Alexa Fluor 488 («e-Bioscience»).

Оценивали процент СD14+-моноцитов,экспрессирующих TLR2 или TLR4 (рис. 7), а также среднюю интенсивностьфлюоресценции (СИФ) этих рецепторов на СD14+-моноцитах периферическойкрови у больных бронхиальной астмой и здоровых доноров (рис. 8). Среднююинтенсивность флюоресценции рассчитывали как отношение интенсивностифлюоресценции образца, TLR2+ или TLR4+, к интенсивности флюоресценцииизотипического контроля.Показатель средней интенсивности флюоресценции клеток отражаетколичество исследуемых рецепторов, с которыми связались моноклональныеантитела с соответствующей флюоресцентной меткой.

Таким образом, СИФпрямо пропорционален экспрессии рецепторов на поверхности клеток.55Рисунок 7. Типичные диаграммы Dot Plot: А. Dot Plot с выделенным гейтом WBC.Б. Dot Plot с выделенным гейтом СD14+ моноцитов.Рисунок 8. Типичная гистограмма свечения TLR2 на CD14+ моноцитахпериферической крови здоровых доноров (А) по сравнению больными БА (Б).2.5. Выделение мононуклеарных клеток из периферической кровичеловекаМононуклеарные клетки выделяли из периферической крови человека водноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина (метод Boyum).В стерильных условиях 10 мл гепаринизированной крови разводили в 3 разакультуральной средой PRMI-1640 при комнатной температуре. Разведеннуюкровь тщательно перемешивали и наслаивали на раствор фиколл-урографина(1,077 г/см3), в соотношении 1:3, после чего центрифугировали в течение 45минут при 1700 об/мин.

После центрифугирования собирали интерфазное кольцо,содержащее кольцо мононуклеарных клеток. Трижды отмывали МНК в среде56RPMI 1640 при 1500 об/мин. в течение 15 минут. Выделенные МНКресуспендировали в 1 мл среды RPMI 1640. Для подсчета выделенных изпериферической крови мононуклеарных клеток использовали камеру Горяева.Жизнеспособность клеток оценивали путем окрашивания клеток 0,1% растворомтрипановогосинего.Жизнеспособностьклетокпослевыделенияикультивирования была выше 95%.2.6. Культивирование МНК периферической крови человекаДля дальнейшей работы использовали МНК периферической крови вконцентрации 1х106/мл.

Клетки стимулировали лигандами TLR2 и TLR4. Вкачестве лиганда TLR2 использовали пептидогликан (Staphylococcus aureus,«InvivoGen») в концентрации 2,5 мкг/мл; в качестве лигандов TLR4 использовалилипополисахарид (E.сoli 0111:B4, «Sigma») в концентрации 0,1 мкг/мл, Der p(«Биомед им. Н.И. Мечникова», Россия) в концентрациях 10 мкг/мл и 1 мкг/мл, атакже комбинацию ЛПС (0,1 мкг/мл) и Der p (10 мкг/мл и 1 мкг/мл).

МНКкультивировали в полной среде RPMI 1640, содержащей антибиотик –гентамицин (100 мкг/мл), 5% эмбриональную телячью сыворотку и L-глутамин.После стимуляции клетки культивировали в течение 24 часов в СО2-инкубаторе(t=37оС, CO2 5%). В качестве контроля использовали МНК, культивированныетольковполнойсредеRPMI1640.Поокончаниикультивированиястимулированные лигандами TLR2 и TLR4 МНК осаждали центрифугированием(15 минут, 1000 об/мин). Полученные супернатанты хранили не более 3 месяцевпри -70оС.2.7.Определениеконцентрациицитокиноввкультуральныхсупернатантах методом иммуноферментного анализаДля определения концентрации цитокинов (TNFα, IL-18, IL-33, IL-4, IL-13,IL-10) в полученных супернатантах МНК периферической крови использовалиметод твердофазного иммуноферментного анализа (коммерческие наборы дляиммуноферментного анализа фирмы e-Biosciences (США)). Принцип методаосновываетсянасвязыванииисследуемыхвеществ(цитокинов)со57специфическими антителами, сорбированными в ячейках планшета.

Добавляемыйконъюгат - биотинилированные поликлональные антицитокиновые антитела,связывают цитокин, захваченный первыми антителами. После инкубации ипромывки из ячеек удаляется несвязавшийся биотиновый конъюгат, и в ячейкидобавляетсяконъюгатстрептавидин-пероксидазы,связывающийбиотин,конъюгированный с антителами к цитокинам. После второй инкубации ипромывки из ячеек удаляется несвязавшийся стрептавидиновый конъюгат, и вячейкидобавляетсясубстратныйраствор,которыйвзаимодействуетсферментным комплексом с образованием окрашенного раствора.Анализ проводился согласно методике, описанной в инструкции.Результаты учитывали на микропланшетном фотометре Anthos 2020 (BCA,Lowry, Bradford) при длине волны 450 нм.

На основании данных полученных длястандартных образцов автоматически строилась калибровочная кривая, покоторой затем определяли концентрацию цитокинов в образцах.Примеры калибровочных кривых, полученных в ходе исследования,представлены на рисунках 9, 10.Рисунок 9. Типичный вид калибровочной кривой: ось абсцисс концентрация цитокина (IL-10 (пг/мл)) в известных стандартах, ось ординат оптическая плотность исследуемого образца с неизвестной концентрацией.58Рисунок 10. Типичный вид калибровочной кривой: ось абсцисс концентрация цитокина (IL-33 (пг/мл)) в известных стандратах, ось ординат оптическая плотность исследуемого образца с неизвестной концентрацией.2.8.

Оценка экспрессии генов TLR2, TLR4 в мононуклеарных клеткахпериферической крови человека2.8.1 Выделение РНК из мононуклеарных клеток периферической кровичеловекаВыделенныемононуклеарныеклеткипериферическойкровистабилизировали с помощью реагента RNAprotect Cell Reagent (QIAGEN). РеагентRNAprotect Cell Reagent добавляли к мононуклераным клеткам периферическойкрови, находящимся в среде, сразу после их получения. Для выделения РНКиспользовали по 1 млн клеток от каждого исследуемого образца.