Диссертация (Анализ экспрессии и функциональной активности Toll-подобных рецепторов у больных бронхиальной астмой), страница 2

Роль TLR в иммунопатогенезе бронхиальной астмы до конца невыяснена. Известно, что TLR участвуют в поляризации иммунного ответа всторону T-хелперов 1-го типа (Th1) или T-хелперов 2-го типа (Th2), напримердействие лигандов TLR в раннем детском возрасте может индуцироватьсозревание Th1.

С другой стороны бытовые аллергены (в частности, аллергенклещей домашней пыли) способны индуцировать TLR-зависимый сигнальныйпуть и способствовать поляризации иммунного ответа в сторону Th2 типа [250].Контаминация аллергенов такими распространенными лигандами TLR, как ЛПСили β-глюканы, может приводить к развитию хронического воспаления иусугублять тяжесть течения заболевания [66]. Взаимодействие лигандов с TLR,таким образом, может приводить к развитию и усугублению воспаления.Дисбаланс между Th1 или Th2 и продукцией противо- и провоспалительныхцитокинов является одним из основных звеньев патогенеза бронхиальной астмы[246].Большинство современных работ по исследованию роли TLR в патогенезебронхиальной астмы, проведено на животных моделях [79, 151, 177, 245] илиосновано только на изучении экспрессии генов TLR [82, 117, 136, 239].

TLR2 иTLR4 экспрессируются на клетках врожденного иммунитета, осуществляющих«первую линию» защиты от патогенов [173]. Для данных рецепторов характерен7наиболее широкий спектр лигандов, включая аллергены (например, аллергенклещей домашней пыли, Der p) [207, 213]. Исследование механизмовврожденного иммунитета и, в частности, TLR в развитии БА может расширитьнаши представления об иммунопатогенезе этого заболевания, возможныхподходах к коррекции выявленных изменений. Таким образом, изучение ролиTLR2 и TLR4 в патогенезе бронхиальной астмы является актуальной задачейсовременной фундаментальной и клинической иммунологии.В связи с вышеизложенным были сформулированы цель и задачиисследования.Цель: изучить экспрессию и функциональную активность TLR2 и TLR4 намононуклеарных клетках периферической кровибронхиальнойастмойразныхформбольных контролируемой(аллергической,смешаннойинеаллергической) легкого и среднетяжелого течения заболевания.Задачи исследования:1.

Изучить экспрессию генов TLR2 и TLR4 в мононуклеарных клеткахпериферической крови больных контролируемой бронхиальной астмой издоровых доноров.2. Определить экспрессию молекул TLR2 и TLR4 на моноцитах периферическойкрови больных контролируемой бронхиальной астмой по сравнению сгруппой здоровых доноров.3. Оценить функциональную активность TLR2 и TLR4 по индуцированнойпродукции TNFα мононуклеарными клетками периферической крови больныхконтролируемой бронхиальной астмой.4. Оценить спонтанную, TLR2- и TLR4- индуцированную выработку про- ипротивовоспалительныхцитокинов(IL-10,IL-4,IL-13,IL-18,IL-33)мононуклеарными клетками периферической крови больных контролируемойбронхиальной астмой.85.

Изучить влияние аллергена клещей домашней пыли Der p и комбинации Der pс ЛПС на продукцию цитокинов мононуклеарными клетками периферическойкровиздоровыхдоноровибольныхконтролируемойаллергическойбронхиальной астмой среднетяжелого течения.6. Провести сравнительный анализ экспрессии и функциональной активностиTLR2 и TLR4 в МНК периферической крови у больных контролируемойбронхиальной астмой разных форм и степени тяжести.Научная новизна работыВпервые у больных контролируемой бронхиальной астмой проведенокомплексное исследование показателей врожденного иммунитета (экспрессия ифункциональная активность TLR2 и TLR4) в зависимости от формы заболевания(аллергическая, смешанная и неаллергическая) и степени тяжести (легкое исреднетяжелое течение) как по сравнению с группой здоровых доноров, так имежду группами больных.Впервые в исследуемой когорте пациентов было установлено увеличениеэкспрессии и функциональной активности TLR2 и TLR4 по сравнению создоровыми донорами: увеличение уровня экспрессии генов TLR2 и TLR4 в МНКпериферической крови, процента CD14+TLR2+- и CD14+TLR4+- моноцитов, исредней интенсивности экспрессии (СИФ) TLR2 и TLR4 на CD14+ моноцитах, атакже TLR2- и TLR4-индуцированной продукции цитокинов (TNFα, IL-10) МНКпериферической крови.Подтверждено, что в зависимости от тяжести заболевания наблюдаютсяизменения функциональной активности TLR: у пациентов со среднетяжелымтечением заболевания достоверно увеличена TLR2- и TLR4-индуцированнаяпродукция TNFα МНК периферической крови.Впервые показано, что в группе больных контролируемой неаллергическойБА повышен процент CD14+ -моноцитов, экспрессирующих TLR4 (по сравнению9с больными смешанной и аллергической БА), а также СИФ TLR4 на CD14+моноцитах (по сравнению с больными аллергической БА).Впервые было определено, что функциональная активность TLR4 на МНКпериферической крови выше у больных неаллергической БА по сравнению сбольными смешанной и аллергической БА.У больных контролируемойаллергической БА впервые установлено, что TLR2- и TLR4-индуцированнаяпродукция IL-10 МНК периферической крови выше, чем у больных смешаннойформой БА.Впервые была проведена оценка влияния аллергена клещей домашней пылиDer p и комбинации Der p c ЛПС на выработку TNFα, IL-4 и IL-13 МНКпериферическойкровибольныхконтролируемойаллергическойБАсреднетяжелого течения заболевания по сравнению со здоровыми донорами.Показано активирующее влияние Der p и комбинации Der p c ЛПС на продукциюTNFα МНК периферической крови как у здоровых доноров, так и в группеисследуемых больных.Практическая значимостьВпервые выявлены изменения экспрессии и функциональной активностиTLR2 и TLR4 у больных контролируемой бронхиальной астмы разных форм(аллергической, смешанной и неаллергической) легкого и среднетяжелоготечения, что дает возможность ставить новые задачи фундаментальныхисследований механизмов развития данного заболевания.Выявленные изменения экспрессии и функциональной активности TLR2 иTLR4 могут служить потенциальными маркерами степени тяжести и прогнозазаболевания, в перспективе могут выступать в качестве критериев направленногопоиска путей коррекции при терапии бронхиальной астмы разных форм, оценкиэффективности проводимой терапии.10Положения, выносимые на защиту:1.

Изменения экспрессии TLR2 и TLR4 в МНК периферической крови убольныхконтролируемойбронхиальнойастмойхарактеризуютсяповышением экспрессии генов TLR2 и TLR4, процента CD14+TLR2+ иCD14+TLR4+ моноцитов, средней интенсивности флюоресценцииэтихрецепторов на поверхности CD14+моноцитов по сравнению со здоровымидонорами.2. У больных контролируемой бронхиальной астмой повышена функциональнаяактивность TLR2 и TLR4 в МНК периферической крови по сравнению создоровыми донорами. Увеличение функциональной активности TLR2 и TLR4 вМНК периферической крови сопровождается усилением тяжести теченияаллергической БА.3. Аллерген клещей домашней пыли Der p и совместное действие аллергенаклещей домашней пыли Der p с ЛПС приводит к увеличению продукции TNFαМНК периферической крови у здоровых доноров и больных контролируемойаллергической БА среднетяжелого течения.4.

У больных контролируемой неаллергической БА процент CD14+TLR4+моноцитов,средняяинтенсивностьфлюоресценцииTLR4иTLR4-опосредованная продукция TNFα МНК периферической крови выше посравнению с больными аллергической и смешанной БА. У больныхконтролируемой аллергической БА повышена TLR2- и TLR4-индуцированнаяпродукция IL-10 МНК периферической крови по сравнению с больнымисмешанной БА.11Личный вклад автораАвтор участвовал в выборе направления исследований диссертационнойработы, разработке дизайна исследования, подборе когорты исследуемыхпациентов (под руководством научных руководителей).

Автором лично проведенався экспериментальная работа, включающая в себя: выделение и культивированиемононуклеарных клеток, проведение иммуноферментного анализа, работа напроточном цитофлюориметре, выделение нуклеиновых кислот из клеток ипостановка полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реальноговремени. Самостоятельная статистическая обработка полученных данных, анализрезультатов исследования. Написание всех глав диссертационной работы,включая формулировку выводов и практических рекомендаций.Апробация результатов диссертационной работыДиссертация апробирована на заседании кафедры иммунологии МБФФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России 24 апреля 2018 года,протокол № 19.Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научныхзаседаниях кафедры иммунологии, и представлены на Межрегиональном форумес международным участием «Клиническая аллергология и иммунология –междисциплинарныепроблемы»,Общероссийскомнаучно-практическоммероприятие «Эстафета Вузовской науки-2017» в рамках Международногомедицинского форума «Вузовская наука.

Инновации», на XII Международной/XXI Всероссийской Пироговской научной медицинской конференции студентов имолодых ученых.По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 7 визданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертаций насоискание ученой степени кандидата медицинских наук.12Внедрение результатов в практикуРезультаты диссертационной работы используются в процессе обучениястудентов 2-3 курсов, ординаторов по специальности «Аллергология ииммунология» и аспирантов по специальности «Клиническая иммунология,аллергология», а также внедрены в научный процесс на кафедре иммунологииМБФ (зав. каф.- д.м.н., профессор Л.В. Ганковская) ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России.Материалы проведенных исследований включены в программу лекций длястудентов, используются при проведении практических занятий на кафедрепатофизиологии и клинической патофизиологии лечебного факультета (зав.

каф.д.м.н., профессор Ж.М. Салмаси) ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. ПироговаМинздрава России.Результатыработывнедренывпрактическуюдеятельностьиммунологической лаборатории ГБУЗ ДГКБ № 9 им. Г.Н. СперанскогоДепартамента здравоохранения города Москвы (гл.врач - д.м.н., профессорКорсунский А.А.)Объем и структура диссертацииДиссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, состоит извведения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатовсобственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и спискалитературы, включающего 251 источников (4 отечественных и 247 зарубежных).Работа содержит 7 таблиц и 37 рисунков.13ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1 Характеристика Toll-подобных рецепторовВ процессе эволюции вида закреплялись гены, кодирующие рецепторы —мембранные или растворимые молекулы, обладающие пространственнымсродством к PAMP (патоген-ассоциированные молекулярные паттерны) - паттернраспознающие рецепторы (pattern recognition receptors, PRR).

Они выявляются урастений, беспозвоночных (губки), млекопитающих и прочих многоклеточныхорганизмов, включая человека. Эти рецепторы экспрессируются на поверхностиклеток организма и в эндосомах, в которые попадают чужеродные агенты прифагоцитозе [100].В настоящее время известно несколько семейств сигнальных PRRs,локализующихся на мембранах клетки или во внутриклеточных везикулах:1. Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLR),2.

Лектиновые рецепторы С-типа (C-type lectin receptors, CLRs),3. Рецепторы-«мусорщики» или фагоцитарные рецепторы (scavenger receptors,SRs),4. NOD-подобные рецепторы (NOD-like receptors, NLRs),5. RIG-подобные рецепторы (RIG-I-like receptors, RLRs).PRR, не относящиеся к классу сигнальных рецепторов, преимущественнопредставлены растворимыми соединениями, функция которых ограничена исводится к специфической опсонизации антигенов. К ним относят семействокомплемента, пентраксины, коллектины [100]. Обычно в ответ на микроорганизмв клетке активируется одновременно или последовательно несколько разных PRR.Ключевую роль в защите организма от патогенов играют Toll-подобныерецепторы. Изначально было показано, что ген, кодирующий белок Toll, вовлеченв эмбриональное развитие Drosophila.