Диссертация (Анализ экспрессии и функциональной активности Toll-подобных рецепторов у больных бронхиальной астмой), страница 15

Существуют отдельные исследования по изучению полиморфизмовTLR2 и TLR4 при бронхиальной астме, продукции цитокинов МНКпериферическойкрови,противоречивый характер.однакоданныеимеютразрозненныйили102В настоящей работеиспользован трехэтапный подход для оценкиTLR2 и TLR4 на МНК периферической крови у больных контролируемойбронхиальной астмой различных форм (аллергическая, смешанная инеаллергическая) и тяжести течения заболевания (легкая и среднетяжелая).Сравнение проводили как с группой здоровых доноров, так и междубольными контролируемой БА в зависимости от формы и степени тяжестизаболевания.

Экспрессию и функциональную активность TLR2 и TLR4оценивали на МНК периферической крови и СD14+ моноцитах. Данныйподход был разработан на кафедре иммунологии медико-биологическогофакультета ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова [2] и включает триосновных этапа.1 этап: анализ экспрессии генов TLR2 и TLR4 в МНК периферическойкрови больных БА и здоровых доноров.2 этап: исследование экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности CD14+моноцитов.3 этап: оценка функциональной активности TLR2 и TLR4 по лигандиндуцированной продукции TNFα.Также в работе оценивалась спонтанная и индуцированная лигандамиTLR2иTLR4продукцияМНКпериферическойкровипро-ипротивовоспалительных цитокинов, участвующих в иммунопатогенезе БА(IL-18, IL-33, IL-10, IL-4, IL-13) [11, 19, 85, 132, 146, 236, 242].При проведении исследования выявили, что в 1 группе больныхаллергической БА легкого и среднетяжелого течения заболевания повышенаэкспрессия генов TLR2 и TLR4 в МНК периферической крови в 2,3 (p<0,05) и1,9 раз, соответственно, по сравнению со здоровыми донорами, при этомуровни экспрессии гена TLR2 в МНК больных легкой и средней степенитяжести были сопоставимы.

Достоверное увеличение экспрессии гена TLR4по сравнению с группой здоровых доноров выявили только у больныхаллергической бронхиальной астмой среднетяжелого течения (в 5 раз,p<0,05).ПовышениеуровняэкспрессиигеновTLR2иTLR4при103бронхиальной астме выявили в экспериментальных работах на мышиныхмоделях [82, 84, 117]. Кроме того, в работе Diogenes S. Ferreira и соавт. [58]было показано, что экспрессия генов TLR2 и TLR4 увеличена на клеткахслизистых оболочек дыхательных путей у больных тяжелой аллергическойБА, закончившейся летальным исходом.

В нашем исследовании экспрессиягенов TLR2 и TLR4 была наиболее выражена у больных со среднетяжелымтечением заболевания, что сопоставимо с имеющимися данными литературы.На 2-м этапе оценивали экспрессию TLR2 и TLR4 на моноцитахпериферической крови. У больных аллергической БА вне зависимости отстепенитяжестизаболеванияпроцентCD14+TLR2+иCD14+TLR4+моноцитов выше, чем у здоровых доноров (p<0,0001 и p<0,0001,соответственно).

Средняя интенсивность флюоресценции TLR2 и TLR4 наCD14+ моноцитах также была повышена в группе больных аллергическойбронхиальнойастмой(p<0,0001иp<0,05,соответственно),чтосвидетельствует об усилении экспрессии TLR2+ и TLR4+ на моноцитахпериферической крови больных аллергической БА независимо от тяжеститечения заболевания. Данные литературы об экспрессии TLR на клеткахпериферической крови у больных аллергической БА носят разрозненныйхарактер [44, 158]. Наши исследования совпадают с данными работы СrespoLesmanna и соавт., в которой показано увеличение экспрессии данныхрецепторов на клетках макрофагально-моноцитарного ряда как в мокроте,так и в периферической крови [44].На 3-м этапе при оценке функциональной активности TLR2 и TLR4 убольных аллергической БА выявили увеличение лиганд-индуцированнойпродукцииTNFα по сравнению со здоровыми донорами (p<0,05).Повышение функциональной активности TLR2 и TLR4 может быть связанос полиморфизмами генов этих рецепторов.Не выявили различий в TLR2-опосредованной продукции TNFα убольных аллергической БА легкой и среднетяжелой БА , при этом у больныхсо среднетяжелым течением значения TLR4-опосредованной продукции104TNFα были выше, чем у больных с легким течением (p<0,05).

Повышенныезначения могут быть связаны с увеличением экспрессии гена TLR4 в МНКбольных среднетяжелой аллергической БА и с высокой функциональнойактивностью TLR на клетках периферической крови больных БА. TNFα –провоспалительныйцитокин,вырабатываемыйпреимущественномоноцитами и макрофагами в первые 30 минут после индукции воспаления[57]. Опосредуя свое действие через транскрипционный фактор NF-κB, TNFαзапускает множество различных реакций, в том числе, увеличениеэкспрессии молекул адгезии, а также усиление миграции нейтрофилов иэозинофилов и синтез других провоспалительных цитокинов и хемокинов[243].У больных аллергической БА спонтанная продукция IL-10, IL-18 и IL-4МНК периферической крови выше, чем у здоровых доноров.

При этомуровеньTLR2-иTLR4-индуцированнойпродукцииIL-10МНКпериферической крови у больных аллергической БА значительно выше, чему здоровых доноров (p<0,05) и больных смешанной БА (p<0,05) инеаллергическойБА(p>0,05).Известно,чтоIL-10подавляетдифференцировку Th1 типа [29], что приводит к преобладанию Th2иммунного ответа. Th2 лимфоциты являются одним из основных источниковIL-4, который участвует в переключении изотипов иммуноглобулинов на IgE[242].

Несмотря на повышенный уровень спонтанной продукции IL-4 МНКпериферической крови больных АБА по сравнению со здоровыми донорами(p<0,05), лиганды TLR2 или TLR4 (ПГ и ЛПС, соответственно) не влияли науровень IL-4 в МНК периферической крови. Это может быть связано с тем,что на лимфоцитах периферической крови, основных продуцентах IL-4,исследуемые TLR представлены в меньшей степени, чем на моноцитах [4].Недавно стало известно, что TLR4 может принимать участие враспознавании бытовых аллергенов, в частности, Der p [178, 208]. В связи сэтим, мы выделили внутри группы больных аллергической БА пациентов ссенсибилизацией к домашней пыли.

Была проведена оценка спонтанной и105индуцированной Der p продукции МНК периферической крови TNFα, IL-4 иIL-13.Нами выявлено, что в ответ на аллерген клещей домашней пыли (Der p)происходит увеличение продукции TNFα МНК периферической кровибольных аллергической бронхиальной астмой и здоровых доноров (p<0,05).На продукцию IL-4 и IL-13 МНК периферической крови Der p не влияет. Приэтом у больных БА индуцированная Der p продукция TNFα достоверновыше, чем у здоровых доноров (p<0,05).Согласно литературным данным, увеличение содержания ЛПС вдомашней пыли коррелирует с усилением тяжести БАMichel O.

и соавт.[141]. Работамипоказано, что содержание ЛПС в домашней пыликолеблется от 300 до 18 000 нг/г [141, 169]. У пациентов с бронхиальнойастмой средней степени тяжести вдыхание воздуха, содержащего небольшиеколичества ЛПС (250 нг/м3), за 4 часа до проведения провокационных тестовс аллергенами приводило к усилению реактивности бронхов и эозинофилии[141, 165]. В работе Hunt L. и соавт.было показано, что контакт саллергеном, контаминированным ЛПС, приводит к увеличению количестванейтрофилов в бронхоальвеолярном лаваже у пациентов с бронхиальнойастмой [88]. На следующем этапе исследования мы выявили, что в ответ нааллерген клещей домашней пыли (Der p) в комбинации с ЛПС такжепроисходит увеличение продукции TNFα МНК периферической кровибольных аллергической бронхиальной астмой и здоровых доноров (p<0,05).При этом уровни TNFα у больных БА выше, чем у здоровых доноров(p<0,05).

Аллерген клещей домашней пыли (Der p) и совместное действиеDer p с ЛПС не приводит к увеличению выработки IL-4 и IL-13 МНКпериферической крови больных БА и здоровых доноров.Сочетанноедействие Der p с ЛПС имело тенденцию к повышению продукции TNFα посравнению со стимуляцией только Der p, однако данные не былидостоверными. ЛПС присутствует как в стенке грамотрицательных бактерий,так и является компонентом домашней пыли [53], это может способствовать106постоянной активации TLR4. Сочетанное воздействие причинно-значимогоаллергена и ЛПС на организм пациентов с аллергической БА можетспособствоватьформированиюПолученныеданныемогутобоснованияназначенияубытьбольногосмешаннойиспользованыпостояннойбазиснойвформыБА.дальнейшемдлятерапиибольнымссенсибилизацией к аллергенам клещей домашней пыли.Смешанная бронхиальная астма сочетает в себе признаки какаллергической, так и неаллергической бронхиальной астмы.

На 1 этапеисследования, у пациентов этой группы наблюдалось увеличение экспрессиигенов TLR2 в 2,8 раза (p<0,05) и TLR4 в 3,4 раза (p<0,05) по сравнению создоровыми донорами. На втором этапе выявили, что у больных смешаннойБА увеличен процент CD14+TLR2+(p<0,0001) иCD14+TLR4+ (p<0,01)моноцитов, а также СИФ TLR2 (p<0,0001) и TLR4 (p<0,01) по сравнению создоровыми донорами. На третьем этапе выявили, что у больных смешаннойБА повышена спонтанная продукции TNFα, IL-10, IL-18 и IL-4 по сравнениюсо здоровыми донорами (p<0,05). Увеличена TLR2- и TLR4-индуцированнаяпродукция TNFα и IL-10 МНК периферической крови по сравнениюздоровымидонорами(p<0,05).Особенныйинтерессопредставляютполученный нами данные о том, что TLR4-индуцированная продукция TNFαМНК периферической крови у больных смешанной БА достоверно выше, чему больных аллергической БА (p<0,05).

Существенных различий по другимисследуемым показателям между больными смешанной и аллергической БАне было выявлено. Возможно, что именно увеличение функциональнойактивности TLR4 способствует формированию смешанного типа воспаленияв данной группе больных и развитию обострений при присоединении к БАбактериальной или вирусной инфекции.В группу больных неаллергической БА вошли пациенты безсенсибилизации к аллергенам и данных о наличии атопии.