Диссертация (Анализ экспрессии и функциональной активности Toll-подобных рецепторов у больных бронхиальной астмой), страница 14

Возможно, продукция данного цитокина в ответ на стимуляцию TLRвозможна только на местном уровне [166].94Wang L. и соавт. и Lee Y. и соавт. показали значимое увеличение уровняIL-13 у пациентов c бронхиальной астмой в остром периоде, по сравнению спациентами с БА в ремиссии [121, 221]. Сопоставимые уровни спонтаннойпродукции IL-13 МНК периферической крови, полученные в процессепроведения нашего исследования, возможно могут быть связаны с тем, что вданное исследование были включены пациенты с контролируемой БА (то есть,находящиеся в стадии ремиссии заболевания).3.5 Исследование влияния Der p и комбинации Der p с ЛПС напродукцию TNFα, IL-4, IL-13 у больных аллергической бронхиальнойастмой.Согласно последним данным, TLR4 может принимать участие враспознавании бытовых аллергенов, в частности Der p [178, 208]. В связи с тем,что аллерген клещей домашней пыли широко распространен в окружающейсреде и часто контаминирован липополисахаридом [213], на следующем этапенашей работы мы изучали влияние аллергена Der p и его совместное действие сЛПС на продукцию TNFα МНК периферической крови больных БА и здоровыхдоноров.

Для исследования были выбраны пациенты, страдающие аллергическойБА с сенсибилизацией к бытовым аллергенам.В группе здоровых доноров наблюдалось увеличение выработки TNFαМНК периферической крови в ответ на стимуляцию Der p в концентрациях 10мкг/мл и 1 мкг/мл по сравнению с контролем: 411,2 (296,7-625,6) и 447,5 (425,3496,5) против 118 (50,0-190,6), соответственно (рис. 33).У больных бронхиальной астмой концентрация TNFα после стимуляцииМНК Der p в концентрациях 10 мкг/мл и 1 мкг/мл составили 1270,1 (863,81365,2) пг/мл и 1145,0 (805,6-1421) пг/мл, соответственно, против 481,8 (471,6596,2) пг/мл в контроле (рис.

33).При этом у больных БА Der p-индуцированная продукция TNFα выше, чему здоровых доноров (p<0,05). Таким образом, выявлено, что Der p оказывает95стимулирующее влияние на продукцию TNFα МНК периферической кровибольных аллергической БА с сенсибилизацией к бытовым аллергеном.Рисунок 33. Спонтанная и Der p-индуцированная продукция TNFαмононуклеарными клетками здоровых доноров и больных аллергическойбронхиальной астмой.УвеличениепродукцииTNFαпослестимуляцииМНКDerpсвидетельствует об активации TLR4 в ответ на действие бытовых аллергеновСогласно литературным данным, у пациентов, страдающих аллергическойбронхиальной астмой с сенсибилизацией аллергеном клещей домашней пыли,наблюдалось усиление тяжести течения бронхиальной астмы при увеличениисодержания ЛПС в домашней пыли.

При этом содержание аллергена в домашнейпыли не оказывало влияния на тяжесть течения бронхиальной астмы [141].96Таким образом, контакт с ЛПС может быть одним из факторов, определяющимувеличение степени тяжести течения бронхиальной астмы.В дальнейшем мы оценивали влияние Der p в сочетании с ЛПС навыработку TNFα МНК периферической крови.

В обеих группах стимуляцияМНК Der p в концентрациях 10 мкг/мл и 1 мкг/мл в комбинации с ЛПС такжеприводила к увеличению выработки TNFα по сравнению с контролем. В группездоровых доноров концентрации TNFα достоверно ниже и составили: 576,5(415,5-986) и 763,2 (413,6-911,3), соответственно (рис.

34).В группе больных БА после стимуляции МНК Der p в концентрациях 10мкг/мл и 1 мкг/мл в комбинации с ЛПС выработка TNFα составила 1330,0 (12391668) пг/мл и 1337,8 (1164-1692) пг/мл, соответственно.Наблюдалась тенденция к увеличению концентрации TNFα в ответ накомбинацию Der p c ЛПС по сравнению с показателями, полученными послестимуляции МНК периферической крови только Der p как у здоровых доноров,так и у больных бронхиальной астмой.

Однако данные не были достоверными.Нами было показано, что различия в концентрации используемогоаллергена не влияют на уровень продукции TNFα МНК периферической кровибольных БА.Таким образом, нами было обнаружено увеличение выработки TNFα МНКпериферической крови больных бронхиальной астмой и здоровых доноров вответ на стимуляцию Der p и комбинацию Der p c ЛПС по сравнению сконтролем. TLR4-опосредованная продукция TNFα в ответ на Der p икомбинацию Der p c ЛПС была выше в группе больных бронхиальной астмой посравнению со здоровыми донорами. Учитывая высокий процент пациентов ссенсибилизацией к бытовым аллергенам, активация TLR4 и усиление выработкипровоспалительных цитокинов в ответ на аллерген клещей домашней пылиможетспособствоватьподдержаниювоспаленияувеличению тяжести течения бронхиальной астмы.дыхательныхпутейи97Рисунок 34.

Продукция TNFα мононуклеарными клетками здоровыхдоноров и больных аллергической БА, стимулированная Der p и комбинациейDer p c ЛПС.На следующем этапе работы оценивали индуцированную Der p исочетанное действие Der p с ЛПС на продукцию IL-13 и IL-4 МНКпериферической крови больных БА с сенсибилизацией к бытовым аллергенам издоровых доноров (рис. 35).98Рисунок 35. Продукция IL-4 мононуклеарными клетками здоровыхдоноров и больных аллергической БА, индуцированная Der p и комбинациейDer p c ЛПС.В группе здоровых доноров абсолютные значения спонтанной продукцииIL-4 МНК периферической крови, а также уровня IL-4 после стимуляции МНКDer p в концентрациях 10 мкг/мл и 1 мкг/мл были сопоставимы и составили:19,57 (17,25-22,36) против 18,41 (16,67-23,09) и 23,6 (18,48-27,5), соответственно.В группе больных БА абсолютные значения выработки IL-4 МНК послестимуляции Der p в концентрациях 10 мкг/мл и 1 мкг/мл составили 23,64 (22,3530,50) пг/мл и 28,78 (25,79-38,62) пг/мл, что было сопоставимо со значениямиспонтанной выработки IL-4: 26,22 (16,32-36,06) пг/мл.

Не выявлено различиймежду группами здоровых доноров и больных БА в спонтанной илииндуцированной продукции IL-4 МНК периферической крови.У здоровых доноровпосле стимуляции МНК периферической кровикомбинацией Der p в концентрациях 10 мкг/мл и 1 мкг/мл с ЛПС абсолютныезначения выработки IL-4 составили 18,41 (15,52-20,74) и 22,92 (18,04-24,5),99соответственно. В группе больных БА после стимуляции МНК комбинацией Derp в концентрациях 10 мкг/мл и 1 мкг/мл с ЛПС абсолютные значения выработкиIL-4 составили 23,64 (17,61-27,50) и 22,78 (21,06-26,65), соответственно. Такимобразом, культивирование МНК периферической крови больных БА и здоровыхдоноров в присутствии Der p или в комбинации Der p с ЛПС не приводит кдостоверному изменению продукции IL-4 у здоровых доноров или больных БА.Абсолютные значения продукции IL-13 МНК периферической крови вгруппе здоровых доноров после стимуляции Der p в концентрациях 10 мкг/мл и1 мкг/мл были также сопоставимы со спонтанной продукцией и составили: 6,71(5,5-10,1) и 4,60 (3,77-5,26) против 7,96 (5,86-8,54), соответственно (рис.

36). Вгруппе больных БА абсолютные значения выработки IL-13 МНК послестимуляции Der p в концентрациях 10 мкг/мл и 1 мкг/мл составили 6,39 (5,647,24) и 6,39 (5,01-7,63), что также было сопоставимо со значениями спонтаннойпродукцией данного цитокина МНК периферической крови: 6,71 (5,6-7,6).Рисунок 36. Продукция IL-13 мононуклеарными клетками здоровыхдоноров и больных аллергической БА, индуцированная Der p и комбинациейDer p c ЛПС.100Стимуляция МНК периферической крови комбинацией Der p с ЛПС такжене приводила к достоверному изменению продукции IL-13 в группах больныхБА и здоровых доноров.

У больных БА после стимуляции МНК комбинациейDer p в концентрациях 10 мкг/мл и 1 мкг/мл с ЛПС абсолютные значениявыработки IL-13 составили 6,64 (5,67- 7,63) и 7,88 (6,76-9,37) против 6,64 (5,677,63) и 5,35 (4,89-6,1) у здоровых доноров, соответственно. Таким образом,между больными БА и здоровыми донорами достоверных различий в продукцииIL-13 МНК периферической крови выявлено не было.Таким образом, было установлено, что активация TLR4 аллергеном, атакже сочетанное действие аллергена и ЛПС не приводит к увеличениювыработки IL-13 и IL-4 мононуклеарными клетками периферической кровиздоровых доноров и больных бронхиальной астмой с сенсибилизацией кбытовым аллергенам.

Однако, как нами было показано ранее, на моноцитахпериферической крови, у больных БА экспрессия и функциональная активностьTLR4 больше, чем в контрольной группе. Моноциты будут мигрировать вподслизистую оболочку бронхов и дифференцироваться в макрофаги. Известно,что на уровне дыхательных путей воздействие ЛПС и аллергенов приводит кувеличению продукции TLR4-опосредованной выработки TSLP, IL-1β, IL-25 иIL-33 [123]. В ответ на IL-25 и IL-33 активируются ILC2 и Th2-лимфоциты, чтосопровождается усилением выработки IL-5, IL-13 и IL-4. Помимо этого, ЛПС,воздействуя через TLR4 на тучных клетках, может приводить к их дегрануляции,что сопровождается увеличением выработки цитокинов [53, 233].

Несмотря наотсутствие TLR-индуцированной продукции IL-13 и IL-4 МНК периферическойкрови, на местном уровне высокая функциональная активность TLR4 можетспособствовать развитию воспаления.101ЗаключениеФакторы врожденного иммунитета играют важную роль в развитии,течении и прогрессировании многих заболеваний, таких как аутоиммунныезаболевания,инфарктмиокарда,острыйдеструктивныйпанкреатит,атопический дерматит и др. [33, 69]. Ключевыми рецепторами врожденногоиммунитетаявляютсяToll-подобныерецепторы.TLRраспознаютконсервативные структуры микроорганизмов, так называемыеPAMP(патоген-ассоциированные молекулярные паттерны) и эндогенные сигналыопасности DAMP [216].

Чрезмерная или недостаточная активация TLR можетпривести к формированию цитокинового дисбаланса, повлиять на процессывоспаления и, в дальнейшем, определить исход и прогноз заболевания [5, 44,45, 159, 172]. Таким образом, изучение механизмов врожденного иммунитетапри различных иммуноопосредованных заболеваниях, в том числе приразвитии аллергических заболеваний, остается важной ключевой проблемойфундаментальной и клинической иммунологии.Накапливаются данные об участии TLR в патогенезе аллергическихзаболеваний. Показано, что β-глюканы, полученные из аллергена клещейдомашней пыли, действуют подобно PAMP и индуцируют TLR-зависимыйпуть активации врожденного иммунитета при аллергических заболеваниях[7, 39, 73, 109, 210]. Однако большинство работ по исследованию роли TLR впатогенезе бронхиальной астмы проведено на животных моделях [79, 151,177, 245] или основано на изучении экспрессии TLR в клетках слизистыхоболочек [82, 117, 210, 226, 240].Всовременнойнаучнойлитературенетработ,посвященныхкомплексному исследованию TLR на клетках периферической кровичеловека.