Диссертация (Анализ экспрессии и функциональной активности Toll-подобных рецепторов у больных бронхиальной астмой), страница 10

Клетки,смешанные с реагентом RNAprotect Cell Reagent, хранили при температуре -70оС.Выделение РНК из мононуклеарных клеток периферической кровиздоровых доноров и больных бронхиальной астмой проводили с использованиемнаборов для выделения РНК на колонках ―RNeasy Plus Mini Kit‖ (QIAGEN) строгов соответствии с инструкцией производителя. Для обеспечения сохранности РНКна каждый 1 мл буфера RT plus было добавлено 10 мкл -МЭ (β –меркаптоэтанола). Рабочий раствор из концентрированногобуфера RPE был59получен путем добавления 4 объемов 96-100% этанола.

На первом этапевыделения РНК мононуклеарные клетки, смешанные с RNAprotect Cell Reagent,осаждали центрифугированием (5 минут, 5000g), после чего к клеткам добавлялилизирующий буфер (350 мкл RLT Plus). На втором этапе к полученному элюантудобавляли 1 объем 70% этанола, ресуспендировали и согласно инструкциифирмы-производителя проводили очистку от геномной ДНК на колонках(Rneasy).НатретьемэтапепроводилиэлюциюРНКвраствор(центрифугированием образца на колонке Rneasy в 50 мкл воды без РНКаз втечение 1 минуты при ≥ 10 000 об/мин).Концентрацию выделенной РНК измеряли при помощи спектрофотометра(NanoDrop 2000, «Thermo Fisher Scientific»).

Концентрация образцов доноров ибольных была в пределах от 120 до 380 нг/мкл.2.8.2 Проведение реакции обратной транскрипцииДля проведения реакции обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) использовали«Набор для проведения реакции обратной транскрипции» (Синтол, РФ).ПостановкареакцииОТпроводитсявдвапоследовательныхэтапасприготовлением смеси №1 и смеси №2. Реактивы для реакции добавляли постандартной схеме (таб.2, 3).Таблица 2 . Расход реагентов для приготовления реакционной смеси №1 припроведении реакции ОТ.РеагентмклПраймер Random-6, 15 ОЕ/мл(шестичленные олигонуклеотиды со случайной1последовательностью)Праймер Oligo(dT)15, 15 ОЕ/мл1ddH2O3мРНК5ddH2O (отрицательный контроль)5Итоговый объем1060Таблица 3.

Расход реагентов для приготовления реакционной смеси №2 припроведении реакции ОТ.реагентколичество (мкл)MMLV-RT, 50 ед/мкл12,5Х Реакционная смесь10ddH2O4Итоговый объем15После внесения образцов пробирку со смесью №1 инкубировались втечение 3 минут при 75°С (Step 1), в дальнейшем пробирки охлаждали до 4°С ипри 4°С в них вносили по 15 мкл смеси №2 (Step2, Step3).

В таблице 4представлен режим обратной транскрипции.Таблица 4. Температурно-временной режим обратной транскрипции.Temperature(0 C)Time (min)Step1Step2Step3753795340102.8.3 Постановка полимеразной цепной реакции с детекцией в режимереального времениДля определения экспрессии генов TLR2 и TLR4 использовали методполимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Реакциюпроводили с применением «Набора реагентов для проведения ПЦР-РВ вприсутствии SYBR Green I» и праймеров, синтезированных на фирме «Синтол»,РФ. Детекцию результатов проводили с помощью амплификатора ДТ—96 (ДНКтехнологии, Россия).

Системы для определения экспрессии генов TLR2 и TLR4были отработаны ранее на кафедре иммунологии МБФ ФГБОУ ВО РНИМУ им.Н.И. Пирогова Минздрава России.61Объемы реактивов для проведения ПЦР-РВ представлены в таблице 5,температурно-временной режим программы для проведения ПЦР-РВ представленв таблице 6.Таблица 5. Объемы реактивов для приготовления реакционной смесидля проведения ПЦР-РВПриготовление смеси для ПЦР-РВОбъем, мклПрямой праймер (TLR2/TLR4/ GAPDH),110 пкмоль/мклОбратный праймер (TLR2/TLR4/ GAPDH),110 пкмоль/мклTaq ДНК-полимераза, 5Е/мкл0,3dNTP, 2,5 мМ2,510 х буфер SYBR Green I2,5MgCl2, 25 мМ2,5dd H2O2,5Общий объем смеси на 1 пробу12Уровни экспрессии TLR контролировали (стандартизировали) по генуGAPDH за счет сходной экспрессии этого гена в мононуклеарных клеткахчеловека.Таблица6.Температурно-временнойрежимпрограммыпроведения ПЦР-РВТемператураВремяЦиклы95,0°С4 мин-94,0°С20 сек40 цикловTm40 секдля62Экспрессию генов TLR оценивали в относительных единицах (ОЕ) пометоду ∆∆Ct относительно эндогенного контроля (ген GAPDH) [128, 184].2.9.

Статистическая обработка результатовОбработка полученных данных проводилась в программном пакете StatSoftStatistica 6.0 и GraphPad Prism 5. При обработке результатов пользовалисьстандартными статистическими методами.Использовалсякритерийхи-квадратдляоценкинормальногораспределения. Оценивалась равность дисперсий в исследуемых выборках.Поскольку соответствие нормальному распредедению и равность дисперсийвыполнялась не во всех группах, то для описания данных использовали медиану,а также 25-й и 75-й процентили (Ме (0,25; 0,75)). Для оценки достоверностиразличий применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Различиесредних показателей считалось достоверным при уровне значимости менее 0,05(p<0,05).63ГЛАВА 3.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1 Анализ экспрессии генов TLR2, TLR4 в мононуклеарных клеткахпериферической крови больных бронхиальной астмойНа первом этапе исследования определяли экспрессию генов TLR2 и TLR4в 3-х группах больных контролируемой бронхиальной астмой легкого исреднетяжелого течения по сравнению со здоровыми донорами.Выявили, что у больных аллергической бронхиальной астмой экспрессиягена TLR2 в 2,3 раза превышает уровень экспрессии этого рецептора у здоровыхдоноров (p<0,05). В группе пациентов со смешанной бронхиальной астмой вмононуклеарных клетках периферической крови экспрессия гена TLR2 в 2,8раза выше по сравнению со здоровыми донорами (p<0,05).

У пациентов,страдающих неаллергической БА, экспрессия гена TLR2 в 2,5 раз выше посравнению со здоровыми донорами (p<0,05). Данные представлены на рисунке11.Рисунок 11. Экспрессия гена TLR2 в мононуклеарных клетках здоровых донорови больных бронхиальной астмой различных форм.64Достоверное увеличение экспрессии гена TLR2 в мононуклеарных клеткахпериферической крови было установлено как для больных аллергической БАлегкой степени тяжести (в 2 раза), так и для больных аллергической БАсреднетяжелого течения заболевания (в 2,4 раз) (рис.

12).Рисунок 12. Экспрессия гена TLR2 в мононуклеарных клетках здоровыхдоноров, больных легкой и среднетяжелой аллергической бронхиальной астмой.ЭкспрессиягенаTLR4вМНКпериферическойкровибольныхаллергической БА превышала показатели в группе здоровых доноров в 1,9 раз. Вгруппе пациентов со смешанной бронхиальной астмой в мононуклеарныхклетках периферической крови экспрессия гена TLR4 в 3,4 раза выше посравнению со здоровыми донорами (p<0,05), у больных неаллергической БА - в2,5 раза (p<0,05, рис. 13).65Рисунок 13.

Экспрессия гена TLR4 в мононуклеарных клетках здоровых донорови больных бронхиальной астмой различных форм.ВдальнейшемизучалиуровеньэкспрессиягенаTLR4вМНКпериферической крови у больных контролируемой аллергической БА взависимости от степени тяжести заболевания по сравнению с группой здоровыхдоноров.Было выявлено, что у пациентов со среднетяжелым течением заболеванияуровень экспрессии гена TLR4 в МНК периферической крови в 5 раз выше посравнению со здоровыми донорами (p<0,05, рис 14). Таким образом, былоустановлено, что при аллергической бронхиальной астме среднетяжелоготечения заболевания уровень экспрессии гена TLR4 в МНК наиболее высокий.66Рисунок 14.

Экспрессия гена TLR4 в мононуклеарных клетках здоровыхдоноров, больных легкой и среднетяжелой аллергической бронхиальной астмой.Известно, что TLR2 и TLR4 хорошо представлены на различныхгемопоэтических и негемопоэтических клетках, таких как моноциты/макрофаги,эпителиальные клетки и пр. Эти клетки первыми взаимодействуют с патогенами,какбактериальной/вируснойприроды,такиразличнымиаллергенами(например, аллергены клещей домашней пыли, Der p) [208]. Высокий уровеньэкспрессии генов TLR2 и TLR4 может свидетельствовать о вовлечении данныхрецепторов в патогенез заболевания, активации механизмов врожденногоиммунитета при развитии бронхиальной астмы. Повышение экспрессии геновTLR2 и TLR4 в МНК периферической крови больных БА может бытьобусловлено различными факторами.

У больных неаллергической и смешаннойастмой повышение экспрессии генов данных рецепторов может быть связано сраспознаванием лигандов различных патогенов. У больных аллергической БА –с постоянным контактом с аллергенами.673.2 Определение экспрессии TLR2, TLR4 на поверхности моноцитовпериферической крови больных бронхиальной астмойАнализ экспрессии TLR на CD14+моноцитах периферической кровипроводили методом проточной цитофлюориметрии (рис. 15).Рисунок 15. Популяции клеток крови: регионы гранулоцитов, моноцитов илимфоцитовОценивали среднюю интенсивность флюоресценции, а также процентCD14+ моноцитов периферической крови, экспрессирующих TLR2 или TLR4.Среднюю интенсивность флюоресценции (СИФ) рассчитывали какотношение интенсивности флюоресценции образца, TLR2+ или TLR4+, кинтенсивности флюоресценции изотипического контроля на CD14+ моноцитахпериферической крови здоровых доноров (рис. 16) и больных БА (рис.

17).68Рисунок 16. Типичные гистограммы свечения изотипического контроля иTLR2 на CD14+ моноцитах периферической крови здоровых доноров (А),изотипического контроля и TLR2 на CD14+ моноцитах периферической кровибольных контролируемой БА (Б).Рисунок 17. Типичные гистограммы свечения изотипического контроля иTLR4 на CD14+ моноцитах периферической крови здоровых доноров (А),изотипического контроля и TLR4 на CD14+ моноцитах периферической кровибольных контролируемой БА (Б).69Во всех группах обследованных больных бронхиальной астмой выявилистатистическидостоверноеувеличениепроцентаCD14+моноцитовпериферической крови, экспрессирующих TLR2, по сравнению с группойздоровых доноров (рис 18).Рисунок 18.

Процент CD14+ моноцитов периферической крови,экспрессирующих на своей поверхности TLR2, у здоровых доноров и больныхбронхиальной астмой различных форм.В дальнейшем оценивалась средняя интенсивность флюоресценции (СИФ)TLR2 на клетках периферической крови больных БА и здоровых доноров. Быловыявлено, что у больных бронхиальной астмой в исследуемых группах СИФTLR2 на CD14+ моноцитах статистически достоверно выше по сравнению созначениями у здоровых доноров (рис 19).70Рисунок 19. Средняя интенсивность флюоресценции TLR2 на CD14+моноцитах периферической крови у здоровых доноров и больных бронхиальнойастмой различных форм.Не было выявлено различий СИФ TLR2 на CD14+ моноцитах и процентаCD14+TLR2+ моноцитов между разными группами больных бронхиальнойастмой.

У здоровых доноров процент CD14+TLR2+ моноцитов – 78,2 (47,4-87,6%), СИФ – 6,8 (4,6-7,8). Процент CD14+TLR2+моноцитов у больныхаллергической БА (99,9 (99,6-100%), смешанной БА (99,8 (99,7-100)%) инеаллергической БА (99,9 (99,7-100)%) был сопоставим. СИФ TLR2 наCD14+моноцитах периферической крови у больных аллергической БА (13,2 (9,715,9)) смешанной БА (14,1 (10,7-20,7)) и неаллергической БА (15 (11,1-17,8))также не различались между группами.На следующем этапе исследования, определяли процент CD14+моноцитовпериферической крови, экспрессирующих TLR4 в исследуемых группахпациентов по сравнению со здоровыми донорами.