Диссертация (Молекулярные и клеточные механизмы ультрафиолетового сшивания роговицы), страница 2

и соавт., 2012б; Mastropasqua L., 2015; Nemeth G. et al., 2018; NohavaJ. et al., 2018). При этом качество предлагаемых модификаций кросслинкингаопределяется адекватным дозированием УФ излучения и выбором приемлемыхрастворов для фотосенсибилизации и протекции роговицы с учетом ееиндивидуальных особенностей (Дроздова Г.А. и соавт., 2015; Бикбов М.М. исоавт., 2016; 2017; Lombardo M. et al., 2015a, 2017; Razmjoo H. et al., 2017; LhuillierL. et al., 2018).К настоящему времени недостаточно изучены способы оценки активностисвободно-радикальныхпроцессоввроговице,происходящихпослеУФкросслинкинга, особенности изменения локального и системного цитокинового иантиоксидантного статуса человека.

Учитывая продолжительное нахождениесовременного человека в среде искусственных источников освещения, нередкоимеющих повышенную долю ультрафиолета в спектре света (Wong W. et al., 2014;КапцовВ.А.исоавт.,2017),требуютисследованияиобобщенияпатофизиологические аспекты УФ воздействия на орган зрения и организм вцелом. Вышеизложенное послужило основанием для изучения этих вопросов внастоящем исследовании.Степень разработанности темы.

В основном научные исследованиясвязаны с клиническими аспектами применения процедуры УФ кросслинкингароговицы (Spoerl E. et al., 2007; Mazzotta C. et al., 2008; Raiskup F. et al., 2013;Bikbova G., Bikbov M., 2014; Ucakhan O., Bayraktutar B., 2017; Choi M. et al., 2017;Mazzotta C. et al., 2018). Описаны лишь отдельные патофизиологические (ShalchiZ. et al., 2015) и биофизические процессы (Lin J., 2018), происходящие в тканяхроговицы после ее УФ сшивания. Не изучена сопряженность процедурыкросслинкингаспроисходящимииммунобиохимическимииморфофункциональными изменениями (Esquenazi S. et al., 2010). На начальном8этапе находятся исследования о состоянии местных метаболических сдвигов втканях глаза, в особенности, антиоксидантной системы и процессов свободнорадикального окисления, инициируемых УФ излучением.Цельисследования.Установитьзакономерностиимеханизмыультраструктурной трансформации и изменения метаболизма роговицы приультрафиолетовом воздействии.Задачи исследования:1.

Оценить динамику содержания рибофлавина в структурах переднегоотрезка глаза при инстилляциях разработанных офтальмологических растворовдля ультрафиолетового сшивания роговицы.2. Изучить характер изменений биометрических и биомеханическихпоказателейроговицыэкспериментальныхживотныхпослерибофлавин-ультрафиолетового воздействия с фотосенсибилизаторами и без них.3. Исследовать на экспериментальной модели ex vivo сравнительнуюэффективностьабсорбцииультрафиолетовогоизлученияроговицейприиспользовании предложенных растворов рибофлавина и обосновать показания ких применению.4. Оценить активность процессов свободно-радикального окисления втканях и биологических жидкостях глаз экспериментальных животных и ихзначимость в механизмах ультрафиолетового сшивания роговицы.5.Изучитьвэкспериментеособенностиморфологическихиультраструктурных изменений роговицы под воздействием ультрафиолетовогоизлучения, в том числе в присутствии фотосенсибилизаторов, дать оценкукачественного состояния коллагеновых фибрилл в отдаленные сроки.6.

Выявить общие закономерности изменений местных и системныхуровней цитокинов в различные сроки после ультрафиолетового сшиванияроговицы у пациентов с кератоконусом.7. Исследовать особенности локального и общего антиоксидантного статусапациентов с кератоконусом в динамике ультрафиолетового кросслинкингароговицы.9Научная новизна. Впервые установлены механизмы УФ сшиванияроговицынаосновеоценкибиометрических,биомеханических,морфологических, биохимических и иммунных изменений, выявленных наразличных экспериментальных моделях.Показано, что степень проницаемости и динамика интраокулярногосодержаниярибофлавиналабораторныхживотныхвроговицеиобусловленывлагекакпереднейсоставомкамерыглазаразработанныхофтальмологических растворов, так и площадью корнеальной деэпителизации.Получены сведения, отражающие динамику изменений биометрических ибиомеханических показателей роговицы экспериментальных животных, иобоснована необходимость дифференцированного подхода к применениюрибофлавинсодержащих растворов при проведении УФ сшивания роговицы.Выявленоусилениепроцессовсвободно-радикальногоокисленияиизменение метаболизма продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ),реагирующих с тиобарбитуровой кислотой в интраокулярных тканях животныхна фоне ослабления системы антиоксидантной защиты при воздействии УФизлучения, в том числе в присутствии различных растворов рибофлавина.Получены новые данные об ультраструктурной организации коллагеновыхволокон передних и средних слоев корнеальной стромы крыс, проявляющиеся вувеличении диаметра фибрилл и снижении плотности фибриллярной упаковкипосле УФ сшивания роговицы с использованием разработанных раствороврибофлавина.Поданнымконфокальнойприжизненноймикроскопиивыявленыморфологические особенности роговицы животных после УФ воздействия и УФсшивания с растворами рибофлавина, характеризующиеся набуханием стромы,снижением количества кератоцитов в передних и средних слоях стромы в первые30 дней эксперимента с последующим восстановлением архитектоники оптическойоболочки (90 сут) при отсутствии повреждения эндотелия.Показаныстепеньиммунногореагирования,общийилокальныйантиоксидантный статус в различные сроки после УФ сшивания роговицы у10пациентов с кератоконусом.

Установлено, что данная процедура не вызываетзначимых воспалительных реакций, сопровождается кратковременным местнымповышением содержания IL-1β, TGF-1, -2, IFN- в ответ на деэпителизациюроговицы, характеризуется локальным ослаблением антиоксидантного статуса иугнетениемвыработкисупероксиддисмутазыприотсутствиисистемныхизменений.Теоретическая и практическая значимость.

Полученные результатыисследования свидетельствуют о многофакторном характере формированиямеханизмов трансформации роговицы при УФ воздействии на нее, включаярибофлавин-ультрафиолет-индуцированное сшивание, что представляет научнуюоснову для разработки перспективных путей и оригинальных подходов ккоррекции дисбаланса процессов свободно-радикального окисления, про- иантиоксидантной систем, цитокинового статуса.Результаты исследований использованы в процессе разработки научнотехнической документации и испытаний протекторов роговицы «Декстралинк» и«Риболинк».

Разработаны, зарегистрированы и внедрены в клиническую практикуновые медицинские изделия для УФ сшивания роговицы, экспериментальноподтверждена их эффективность и безопасность, предложены практическиерекомендации по применению.Исследования проводились автором в рамках Инновационных проектов погосударственной научно-технической программе Академии наук РеспубликиБашкортостан (2007-2011 гг.), НИР по государственной научно-техническойпрограммеАкадемиинаукРеспубликиБашкортостан(2012-2014гг.).Методология и методы диссертационного исследования. Особенностиинтраокулярных изменений после УФ воздействия без рибофлавина и УФсшивания роговицы исследованы in vivo на экспериментальных моделях сиспользованием«Шиншилла»лабораторныхиexофтальмологическогоvivoнакрыслиниисвиных«УФалинк»Вистар,глазах(Россия),скроликовпомощьюизмерителяпородыустройствамощностиультрафиолетового излучения УФ-радиометр (ООО «НТП ТКА», Россия),контактного пахиметра Tomey SP-100 (Япония), толщиномера Digital linear gauge11EG-100 (Япония), универсальной разрывной испытательной машины МТ-140(«Метротекс», Россия), операционного микроскопа Carl Zeiss (Германия).Количественное определение рибофлавина в свиных и кроличьих роговицахосуществляли с использованием спектрофотометра СФ-56 (Россия); в образцахвлаги передней камеры (ВПК) кроликов – с помощью автоматического ИФАанализатора «Multiscan» и тест-систем ID-Vit (Immundiagnostik, Германия).ЖелезоиндуцированнаяоцениваласьспомощьюилюминолзависимаяхемилюминометраХЛ-003хемилюминесценция(Россия).Продукты,реагирующие с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-рп) определяли с применениемнабора реактивов «ТБК-АГАТ» (Россия) на спектрофотометре СФ-56 (Россия).Оценка общего антиоксидантного статуса и уровня супероксиддисмутазыпроводиласьсиспользованиемтест-системRandoxLaboratoriesLtd.(Великобритания) и «eBioscience» (Австрия) на фотометре SF-Ultra (Россия),StatFax (США) и TECAN INFINITE F-50 (Австрия).Морфологическое изучение гистологических срезов из образцов роговиц крысвыполняли с использованием светового микроскопа LEICA DM 2500 с цифровойфотокамерой LEICA DFC 450 (Leica Microsystems, Германия).

Электроннуюмикроскопию ультратонких срезов средних слоев стромы роговицы крыс проводилис помощью электронного микроскопа «JEM-1011» (Jeol, Япония).Прижизненноепроведеноморфологическоеметодомконфокальнойисследованиемикроскопиисроговицыкроликовпомощьюлазерногосканирующего томографа Heidelberg Retinal Tomographer HRT-III («HeidelbergEngineering», Германия) с насадкой «Rostok».Определение уровня цитокинов выполнялось методом иммуноферментногоанализа с использованием анализатора «Multiscan» (Финляндия) и стандартныхдиагностических наборов «Вектор-Бест» (Россия) и «eBioscience» (Австрия).Морфологическиеиэлектронномикроскопическиеисследованиявыполнялись на базе лаборатории морфологии ФГБУ «Всероссийский центрглазной и пластической хирургии» МЗ РФ при консультативной помощи д.м.н.,профессора С.А.

Муслимова.12Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационнойработы внедрены в учебный процесс на курсах повышения квалификации врачейв научно-образовательном отделе ГБУ «Уфимский научно-исследовательскийинститут глазных болезней Академии наук Республики Башкортостан», накафедрахмедицинскойпатологическойфизикифизиологиискурсомФГБОУВОинформатики,«Башкирскийнормальнойигосударственныймедицинский университет» МЗ РФ.Зарегистрированы и внедрены новые медицинские изделия: устройствоофтальмологическоедляультрафиолетовогооблученияроговицыглаза«УФалинк» (регистрационное удостоверение №ФСР 2009/05489) и протекторроговицы «Декстралинк» (регистрационное удостоверение №ФСР 2010/09071).Указанные медизделия применяются более, чем в 120 клиниках РоссийскойФедерации.Положения, выносимые на защиту.1.Степень проницаемости и динамика интраокулярной концентрациирибофлавина в роговице и переднекамерной влаге глаза экспериментальныхживотных при выполнении ультрафиолетового сшивания обусловлены составомрастворов и площадью корнеальной деэпителизации.2.