Диссертация (Индикаторное значение червей и растений для оценки экологического состояния вермикомпостируемых почв, загрязненных отходами кожевенного и цементного производств), страница 6

Формирование микроядер целесообразно учитывать как маркерный морфологический признак при диагностикезаболеваний, сопровождающихсявоспалительнымпроцессом (Методическиерекомендации, Ростов-на-Дону, 2013).Любойцитоморфологический дефект, повлекший за собой образованиемутации, приводит к проблемам роста и развития, а так же к тератогенным проблемам (Гарипова, 2011).Тест-реакция на условия среды является механизмом, обеспечивающим интертерную целостность.

Система «экстренного реагирования» через стрессовуюреакцию стимулирует молекулярные ресурсы организма к запуску процессовадаптации, что обусловлено разноплановостью и разнонаправленностью адаптив-29ных реакций, представляющих интерес для биоиндикации и биотестирования(цитировано по С. Н. Плесковой, 2009).Исследованиями в области цитогенетических и цитоморфологических изменений в клетках, а именно, микроядерными аберрациями, занимались и занимаются ученые из различных сфер науки: биологии, физиологии, экологии, сельского хозяйства, медицины. Надо отметить, впервые фрагментами ядерного материала в эритроцитах заинтересовался американский физиолог W.

Н. Howell в1890 году. Несколько позже эти мутации были описаны французским гистологомJ. M. J. Jolly в 1905 году, микроядра получили название тельца Хауэлла-Жолли(Howell, 1890-1891; Jolly, 1905; Ильинских, Бочаров, 1986).А. А. Заварзин (1939) в эритроцитах, подвергшихся патологическим изменениям, обнаружил различные по размерному ряду округлые зернышки базофильной природы.

В 40-е годы, ученый сомневался в ядерном происхожденииэтих гранул (Заварзин, 1939).А. В. Васильев (1948) занимаясь патологическими процессами в эритроцитах при анемиях, вызванных болезнью селезенки, указывает, что форма микроядер различная – округлая или овальная, количество телец в клетке динамично –от одиночных гранул до мелкой зернистости цитоплазмы. Ученый высказываетмнение, что микроядра не являются хромосомными аберрациями, это фрагментыядерной мембраны (Васильев, 1948).T. C. Hsu et.

al. (1975) выявил, что разделение маркерных хромосом в анафазе обычно протекает нормально, но когда центромеры расходятся к полюсам,длинные свободные концы могут образовывать выросты дочерних ядер в интерфазе, что и влечет образование микроядер (Hsu, 1975).Известно, что микроядра образуются в поздней телофазе из акроцентрических фрагментов и целых отставших хромосом (Ильинских, Бочаров, 1986).П. М. Мусиенко (1989) установлена зависимость возникновения цитоморфологических аберраций с патологическими процессами, вызывающими лейкоз,лимфосаркому и ряд других онкологических состояний (Мусиенко, 1989).30Ядрышковые организаторы, ответственные за синтез рРНК, отражают кариотипические изменения в структуре клетки, способствуют образованию протрузий типа микроядер, «мостов» и «хвостов» (Заварзин, Харазова, Молитвин,1992).По мнению В.

А. Арефьева и Л. А. Лисовенко (1995) микроядерный тест –это наиболее распространенный метод, показывающий генотоксичность факторовсреды, заключается в определении количества микроядер в интерфазных клеткахкостного мозга или циркулирующей крови (Арефьев, 1995).У червей, которые были подвержены влиянию загрязнения, в гемолимфепроисходит увеличение количества амебоцитов с видоизмененными ядрами (Козлов, 2003).А. А.

Коровушкин, С. А. Нефедова, А. Ф. Яковлев (2004) выявили закономерность чувствительности микроядерного теста при мастите и лейкозе сельскохозяйственных животных (Коровушкин, Нефедова, Яковлев, 2004; Коровушкин,2004; Нефедова, 2011).В дальнейшем, микроядерные мутации были обнаружены не только в эритроцитах, но и в других клетках гемопоэтического ряда. Под действием канцерогенов в период увеличения митотической активности происходит пул патологических митозов в железах внутренней секреции (Гансбургский, 2005).При проведении микроядерного тестирования на выявление генотоксического влияния среды Е. В. Щепетова (2005) обнаружила, что патологические митозы возникают в весенний период (Щепетова, 2005).Для биотестирования радиационного воздействия используют цитоморфологические методы. Наибольшим достоинством является то, что по типам аберраций идентифицируется мутагенное воздействие.

С использованием данного метода становится возможным выявление лиц, у которых уровень хромосомных аберраций повышен и является источником малигнизации клеток (Михайлова, 2007).М. В. Левински (2008) сообщает, что возникновение микроядер в клеткахбуккального эпителия связано с ослаблением иммунной системы, которая не элиминирует аберрантные клетки (Левински, 2008).31В. Н. Манских (2009) обнаружила, что микроядра у земноводных при действии канцерогенов образуются путем интерфазной деминуции хроматина (Манских, 2009).При апоптозе вклад митоза в образование микроядер определяется силойрадиоактивного заражения.

Подсчет клеток с цитоморфологическими патологиями позволяет идентифицировать дозы радиационного воздействия. По наблюдению С. Н. Колюбаевой в лимфоцитах появляются первые аберрации, начиная сшестого часа после воздействия высоких доз радиации. Автор подчеркивает, чтоэто время, совпадает с пулом интерфазной гибели клеток (Колюбаева, 2010).С. А. Нефедова (2011) выявила закономерность динамики микроядер в лейкоцитах полевок в зависимости от условий среды (Нефедова, 2011, Калашников,Нефедова, Коровушкин, 2011).При микроядерном тесте важным является размер хромосом, зависящий отпроцесса появления микроядра в лимфоците (Нефедова, 2011).

Уровень микроядер у популяций, обитающих на территориях, загрязненных нефтепродуктами,пропорционален количеству минорных аллелей (Солтаева, 2013).В энергетическом обмене клеток важную роль играет гликоген, который локализуется в цитоплазме. Для его цитохимического исследования используютШИК-реакцию. По методу Шабадаша гликоген под действием перйодата калияокисляется и образует соединения, которые реагируют фуксин-сернистой кислотой, что вишнево-фиолетовое окрашивание гранул гликогена. Количество гликогена рассчитывается по полуколичественному методу и выражается в процентах(Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. М.: Медицина, 1975).С увеличением фоновых концентраций радионуклидов, количество крупныхгранул Шик-реакции в лимфоцитограмме здоровых особей популяции выше, чемна чистой территории.

Воздействие, которое оказывают радионуклиды на Шикреакцию, отражено при исследовании цитохимических показателей экспериментальных животных с загрязненных территорий (Нефедова, 2011).322.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙРабота проводилась с 2012 по 2015 годы в ФГБОУ ВО «Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.

А. Костычева» в Учебнонаучном инновационном центре «Агротехнопарк» на агротехнологической станции по следующей схеме (рисунок 1).Индикаторное значение червей и растений для оценки экологическогосостояния вермикомпостируемых почв, загрязненныхотходами кожевенного и цементного производствАнализ видового разнообразия червей,способных к биотестированиюРостовые показатели, водоудерживающая способность,оводненность листьев растенийИндикаторные показателирастенийЦитоморфологичекие маркеры(микроядерный тест) в амебоцитах червейЦитохимические маркеры адаптивности в амебецитах червейдля анализа адаптивности к средеХолодоустойчивость, количество,средний вес, выживаемость, репродуктивная активность, восстановление популяцийИндикаторные показатели червейОбоснование использования индикаторных показателей червей и растений дляоценки восстановления токсичных почв методом вермикомпостированияРисунок 1 – Схема исследованийДля исследования индикаторных показателей червей и растений, почвы иотходы получены на территории предприятия по производству цемента ЗАО33«Михайловцемент» и кожевенного производства – в местах отвалов ОСВ АО«Русская кожа».В лабораторных условиях, для выявления индикаторных показателей растений, отражающих ремедиацию токсичных почв вермикомпостированием, былсмоделирован эксперимент, для чего использовали искусственно созданные варианты субстратов с концентрациями тяжелых металлов, аналогичными почвам сосредним (15 г/кг) и сильным (30 г/кг) загрязнением отходами цементного и кожевенного предприятий.Для исследования воздействия загрязнения среды отходами кожевенногопредприятия на индикаторные организмы использовали следующие вариантысубстратов: 1 – контрольный образец почвы, в котором тяжелые металлы в пределах ПДК; 2 – естественная почва с территории отвалов отходов кожевенногопредприятия, содержащая 15 г/кг сухого ОСВ; 2а – экспериментально созданныйсубстрат с добавлением 15 г/кг отходов кожевенного предприятия; 3 –естественная почва с территории отвалов отходов кожевенного предприятия, содержащая 30 г/кг сухого остатка ОСВ; 3а – экспериментально созданный субстратс добавлением 30 г/кг отходов кожзавода.Для исследования воздействия загрязнения среды отходами цементногопредприятия на индикаторные организмы использовали следующие вариантысубстратов: 4 – контрольный образец почвы, в котором тяжелых металлов в концентрациях, допустимых ПДК; 5 – естественная почва с территории отвалов цементного предприятия, содержащая 15 г/кг отходов; 5а – экспериментально созданный субстрат с добавлением 15 г/кг отходов кожевенного предприятия; 6 – естественная почва с территории отвалов цементного предприятия, содержащая 30г/кг отходов; 6а – экспериментально созданный субстрат с добавлением 30 г/кготходов цементного производства.Отбор, транспортировку и анализ проб отходов проводили по ГОСТ17.4.4.02-84 «Охрана природы.

Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа»; 17.4.3.01-83«Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб». В целях контроля34загрязнения почв тяжелыми металлами (ТМ) по ГОСТ 17.4.3.01 отбирали пробысубстратов и определяли концентрацию методом атомно-адсорбционной спектрофотомерии. При описании загрязнения почв использованы Санитарные нормы СанПиН 42-128-4433-87.Для выявления загрязнения почв использованы методики: выявление концентрации цинка (ПНД Ф 16.1.3-95 (с изм.)), меди (ПНД Ф 16.1:2:2.2:3.48-06),хрома, никеля, кобальта, свинца (ПНД Ф 16.1:2:2.2:2.3.78-2013), сухого остатка(ПНД Ф 16.2.2:2.3:3.32-02), сульфат-ионов (ПНД Ф 16.1.8-98 (2008)), нитратионов (ПНД Ф 16.1:2:2.2:3.67-10).Индикаторные показатели изучали на примере реакций на среду червей семейства Дождевые черви (Lumbricina).

В эксперименте использовали червей видов Eisenia fetida (Навозный червь), Dendrobaena octaedra (Восьмигранная дендробена), Octolasion lacteum (Белокончиковый дождевой червь), Lumbricus rubellus(Красноватый дождевик).При исследовании адаптивных свойств червей к среде обитания были учтены следующие индикаторные показатели: холодоустойчивость, выживаемостьособей и коконов (ISO 11268-2:2003 Качество почвы. Воздействие загрязняющихвеществ на земляных червей (Eisenia fetida). Часть 2. Определение воздействия наих размножение (ISO 11268-2:1998, IDT)); вылупляемость молоди из коконов согласно рекомендациям К. С.

Козлова (Козлов, 2003); весовые характеристики червей согласно рекомендациям С. А. Вальковой (2009) (Валькова, 2009); количествогранул в гемолимфе червей, цитохимически выявляемых ШИК-реакцией методомА. Л. Шабадаша (Шабадаш,1947); количество микроядер в амебоцитах червей,выявляемых цитоморфологически, согласно рекомендациям А. А. Коровушкина(Коровушкин, 2004).Популяции червей оценивали по росту и развитию, для чего ежемесячногоподсчитывали численность и определяли возрастной состав.