Автореферат (Функциональное состояние клеток при действии ультразвуковых волн (биохимические и физиологические аспекты)), страница 5

Так, при νм = 520 Гцоблучение образцов в течение 30 с приводило к лейкопении и дегенеративному изменению всех клеток, идентифицируемы только лимфоциты (6–25 на мазок). С увеличением времени до 60 с (частота 1000 Гц) 50% всех сегментоядерных нейтрофилов были дегенеративно изменены, сохранные клетки находились в комплексах.Значительно снижалось общее количество клеток. Наиболее устойчивым к действию и непрерывного, и амплитудно-модулированного УЗ были лимфоциты всехвидов животных, причём устойчивость увеличивалась с уменьшением размераклетки: малые лимфоциты сохранялись дольше других ядросодержащих клеток.С нарастанием времени облучения происходит кариопикноз лимфоцитов.Фрактальным анализом мазков крови установлено, что микроструктура форменных элементов крови здоровых животных после УЗ воздействия (p < 0.05) значительно различается.

По степени и характеру изменения амплитуды и величиныфрактальной размерности сделан вывод, какие клетки реагируют сильнее. Показана закономерность в этих изменениях, выведен интегральный диагностическийиндекс степени влияния фактора (СВФ), который вычисляется через соотношениеугловых коэффициентов в уравнениях регрессии графиков и диаграмм при максимальном значении дисперсии R и изменяется по-разному у больных и здоровыхживотных.

Некоторые результаты приведены в таблице 4(p < 0.05).Нами впервые проведён анализ возможности использования в лабораторныхгематологических исследованиях метода математической нелинейной динамикидля определения состояния клеток крови, что даёт возможность математическимиметодами определить наличие физиологических изменений ткани, разрушения клеточных структур, а также изменение их плотности (вакуолизация, хроматинолиз,фрагментоз). Расчёт СВФ до и после действия УЗ показал, что значение индексаниже 1.179 относительных единиц говорит об изменении состояния ткани. Преимуществом фрактального анализа перед подсчётом лейкограммы является невозможность получить разные результаты в зависимости от расположения мазка крови.19Таблица 4.

Результаты фрактального анализа мазковкрови до и после УЗ воздействия (M, m < 1% от M)Воздействие на кровь как биологическую систему показало возможностьКошка,Контроль1.0168больнаяоднонаправленного воздействия. ВыявКошка, 7Контроль1.3946 лены основные цитоморфологическиелет, здорова0.05 Вт/см2,эффекты модулированного УЗ на эрит1.0949импульсный, 30 сЛошадь, 7роциты, лейкоциты и тромбоциты колет, здорова0.4 Вт/см2,1.1746непрерывный, 60 сшек, собак и лошадей.

Установлена ви0.2 Вт/см2,1.0349 довая чувствительность к импульсно–10 Гц, 30 сКошка, 7лет, здорова0.4 Вт/см2,и амплитудно-модулированному УЗ. Од1.1507800 Гц, 45 снако у всех видов животных имеют место одинаковые эффекты, развивающиеся строго «запрограммированно», каскадно,по схеме: увеличение проницаемости ЦПМ; изменение формы и площади клеток;деструкция и агрегация клеток (рисунки 3–6); изменение цитозоля, вакуолизацияцитоплазмы вначале грануло–, а затем и агранулоцитов; разрыв ЦПМ; кариолизис,фрагментоз, кариорексис и кариопикноз, цитолиз, лейкопения. Стадийность возникновения клеточных деструкций определённа, и не зависит от физиологическогосостояния животного. Степень и глубина регистрируемых изменений зависят отвремени экспозиции на активных частотах.

Выявлены частоты модуляции, действующие направленно только на ядра или цитоплазму клеток крови. Для каждоговида клеток разных видов животных диапазон свой, но есть и общие частоты управления.Многофакторный анализ выявил диапазоны энергетических, частотных и амплитудных интервалов воздействия, идентичные у клеток от животных разного состояния здоровья, пола, возраста и видовой принадлежности. Для непарнокопытных, кошачьих и собачьих УЗ найденных диапазонов модуляции вызывал одинаковые эффекты. Частоты из диапазонов 10–20 Гц, 70–80 Гц, 100–200 Гц и 700–800 Гцнапрямую воздействуют на внутриклеточные структуры.

Начиная с экспозиции10–15 с, физиологически активные частоты действуют на ядросодержащие клеткикрови (прежде всего, на ядерный аппарат), а на безъядерные — начиная с 20–25 спри всех интенсивностях терапевтического УЗ. Глубина эффекта зависит от продолжительности воздействия активной частотой (r ≥ 0.89) на выбранной интенсивности УЗ; для молодых и здоровых животных наступление эффектов происходитна 5–10 с позднее.ЖивотноеПараметры УЗ: ISATA,режим/νм, tэкспСВФ20а)б)Рисунок 3.

Мазки крови МДЖ. а) Кровь собаки. Режим УЗ об- Рисунок 4. Кровь собаки. Вакуработки: ISATA = 0.4 Вт/см2, νм = 300 Гц, tэксп = 30 с; б) Лейкоолизация цитоплазмы и ядер2циты кошки после УЗ (0.4 Вт/см , 30 Гц, 45 с). Включения(0.7 Вт/см2, 200 Гц, 15 с)в цитоплазме нейтрофиловРисунок 5. Кровь лошади. Агрегация тромбоцитов и лейкоцитов. Цитолиз.(0.4 Вт/см2, 50 Гц, 20 с)Рисунок 6.

Кровь собаки. Дегенеративные изменения ядер. 0.4 Вт/см2, 10 Гц, 30 сТаким образом, выявлены основные физиологические механизмы действиямодулированного УЗ на клетки крови животных. Отличия в выявленных диапазонах, спектрах и длительности воздействия УЗ для достижения одинаковых эффектов обусловлены строением и толщиной ЦПМ, размером гранул лейкоцитов и биохимическим составом крови.21ИЗМЕНЕНИЕ СООТНОШЕНИЯ ГРАНУЛОЦИТОВ И АГРАНУЛОЦИТОВФизиологические изменения in vitro грануло– и агранулоцитов в УЗ поленачинаются с гранулоцитов, что подтверждено расчётно-экспериментальными исследованиями динамики изменения лейкограмм разных видов животных. В зависимости от экспозиции наблюдали эффекты активации и подавления функционального состояния клеток крови, вплоть до их повреждения. Установлено, что ведущей причиной физиологических изменений под действием непрерывного УЗ является дозовая зависимость, а в случае модуляционного воздействия — диапазон активных частот и интенсивность.Изменения процентного соотношения лейкоцитов после действия экспериментально подобранного диапазона интенсивностей и частот модуляции, направленно и максимально влияющими на физиологическое состояние лейкоцитов собак, кошек и лошадей, отражены в таблице 5.

Значения угловых коэффициентов bграфиков зависимости уменьшения относительного количества гранулоцитовв крови от продолжительности экспозиции (рисунки 7, 8) вычисляли по формуламуравнения наклона линии регрессии методом наименьших квадратов. Диапазон изменения модуля коэффициента b лежал в пределах от 0.646 до 1.044, что отражаетрост скорости разрушения гранулоцитов в УЗ поле при увеличении времени воздействия и соотносится с данными, полученными по непрерывному УЗ. Динамикаразрушения клеток крови при воздействии до 45 с и после сильно различается, начто указывает разный угол наклона линии регрессии и резкое возрастание (до 1.8и более, вплоть до 2.5) абсолютного значения углового коэффициента для соответствующих фрагментов кривой.Таким образом, установлена физиологическая закономерность однонаправленного изменения соотношения гранулоцитов к агранулоцитам на всех диапазонах частот модуляции и при всех терапевтических интенсивностях УЗ от 0.05 до1.0 Вт/см2.22030456075Время инсонации, сЛ+С 10 ГцЛ+К1 10 ГцЛ+К2 800 ГцЛ+С 20 ГцЛ+К1 30 ГцРисунок 7.

График зависимости изменения процентного содержания гранулоцитов в смесикрови разных видов животных (лошади и собаки;лошади и кошек) от времени воздействия модулированногоультразвукаинтенсивностью0.4 Вт/см2 с различной частотой модуляции.В легенде: Л — лошадь, С — собака, К1, К2 — кошачьи.Л+С 10 ГцЛ+С 20 ГцЛ+К1 10 Л+К1 30 Л+К2 800ГцГцГц0.000-0.200-0.400-0.600-0.646-0.800-1.000-0.875-0.909Таблица 5. Направление физиологического воздействия на лейкоциты в смешанной крови (M,m = 2%; p < 0.05)ЖиГрануISATA, νм, tэксп,Агрануловотлоциты,2Вт/см Гцсциты, %ные%Лошадь.

Контроль5050Собака. Контроль7426Смесь №1. Контроль70303053470.210601684304159204535653032680.7106025752377700 30от 0 доот 66 до6034 *1005347800 306031693051491.010602080Кот №1. Контроль7129Смесь №2. крови лошади и6733кота №1. КонтрольКот №2. Контроль5743Смесь №3 крови лошади и5347кота №2. Контроль304753Смесь39610.4800 45№3602971Смесь №1 крови лошади и собаки (1:1)Гранулоциты, %80706050403020100Примечание. * Агрегация нейтрофилов. Одинаковая вероятность встретить в поле зрения агреРисунок 8. Значения угловых коэффициен- гат из нескольких десятков клеток, либо нетов линий регрессии для графиков разруше- встретить их вовсе.

Большинство клеток разрушены, но идентифицируются.ния гранулоцитов на рисунке 7.-1.200-0.974-1.044ДЕЙСТВИЕ МОДУЛИРОВАННОГО УЛЬТРАЗВУКА НА КЛЕТКИ КРОВИ ИНВАЗИРОВАННЫХЖИВОТНЫХУстановлена возможность направленного УЗ воздействия на клетки кровипри моно– и смешанной инвазии выявленным нами диапазоном, действующим нанейтрофилы и эритроциты больных и здоровых собак: 0.4 Вт/см2, 10–30 и 800–900 Гц.После обработки in vitro крови больных дирофиляриозом (Dirofilaria repens)собак в течение 30 с — наблюдали лейкопению и цитолиз. Обнаружены анизоцитоз, пойкилоцитоз, изменение процентного состава лейкоцитов, их структуры после воздействия в течение 15 с.

У здоровых животных — после 30 с и более. Опре-23делены изменения в лейкограмме заражённых дирофиляриозом и имеющих микрофиляремию животных (таблица 6). Отмечали также уменьшение в 2–2.5 раза числатромбоцитов (p < 0.05). В сыворотке крови установлены крайние пределы колебания активности ферментов АлАТ (100–315 МЕ/л) и ЩФ (340 до 980 МЕ/л); СОЭдо 24 мм/ч.Модуляция 800–900 Гц в течение 15 с вызывала агрегацию лейкоцитов больных дирофиляриозом животных, лизис ядер и ЦПМ. Увеличение времени до 45 сприводило к появлению в мазках теней клеток и полному лизису лимфоцитов. Лейкограмма в целом претерпевала значительные изменения.

Молодые и незрелыеформы клеток в УЗ поле сохранялись значительно дольше. У нейтрофилов установлена последовательная деформация и вакуолизация ядра и цитоплазмы. Частота10–20 Гц также приводила к ядерному сдвигу влево. При этом клетки было сложноидентифицировать, у 20% из них был лизис ядра и /или цитоплазма, а их окраскабыла неоднородна и неспецифична. Ядра могли быть содержать зернистость. Вовсех пробах выявлены тромбоциты увеличенного размера. Увеличение частоты до1000 Гц, интенсивности до 1.0 Вт/см2, а времени до 10 мин показало отсутствие отрицательной реакции со стороны D. repens на бегущую УЗ волну на фоне полнойдеструкции клеток крови. Жизнеспособность паразита сохранялась (рисунок 9).В зависимости от степени тяжести бабезиоза выявлены колебания показателей общеклинического анализа крови в следующих пределах (p < 0.05): содержание эритроцитов — от 1.25 × 1012/л до нормы, тромбоцитов — от 11 × 109/л донормы, лейкоцитов — 2.3–35 × 109/л.

Активность ферментов изменялась (относительная погрешность — не более 1%): АсАТ — до 360 МЕ/л, АлАТ — до510 МЕ/л, ЩФ — до 1340 МЕ/л, ЛДГ — до 847 МЕ/л.Выявлены изменения гематологических показателей при смешанной инвазии:сдвиг ядра влево (юных форм нейтрофилов в лейкограмме более 25%), содержаниегемоглобина, лейкоцитов, эритроцитов — в пределах нормы, тромбоцитов — в 4–5 раз меньше нормы (p < 0.05), активность АлАТ — в 2.7–7.5 раз, АсАТ —в 1.8–4.8 раза, активности ЩФ — в 3–11 раз выше нормы. Лейкограммы характеризовались увеличением (таблица 6) числа моноцитов (в 1.7–5.7 раз), уменьшением количества сегментоядерных нейтрофилов (в 2–4 раза) и лимфоцитов (в 1.7–3.5 раза).24Таблица 6.

Изменение лейкограммы инвазированных собак под действием модулированного УЗ ISATA = 0.4 Вт/см2, p < 0.05Группыживотных /Эνм и tэкспКонтроль:- 1 группа:от 2 до 4здоровые<3.2>животные- 2 группа:смешанная16±2инвазия- 3 группа:от 4 до 8бабезиоз- 4 группа:дирофиляот 1 до 2риозНейтрофилыБМЛот 0 до 2<1.0>от 2 до4<3.1>3.2±1.0ЮПСот 22 до 43<29>0от 3 до 7<3.4>от 44 до 69<57>9.6±1.012.3±0.723±214±222.0±1.2от 0 до 1от 5 до7от 12 до 35—от 6 до 8от 42 до 65от 1 до 2от 3 до7от 6 до 8от 5 до 8от 8 до 10от 69 до 72от 2 до 10 (лизисот 6 до 49 (разЦПМ и ЦП. Иден- от 5 до 2810–20 Гц,рыв ЦПМ, ядер,0тифицировать(агрегация,025–30 свакуолизациясложно. Включелизис)ядер и ЦП)ния)Все клетки в мазке.