Автореферат (Функциональное состояние клеток при действии ультразвуковых волн (биохимические и физиологические аспекты)), страница 4

П. Кузнецова [1984], оценивается методом иммуноферментного анализа “ELISA-тест” на твердофазном носителе113Рисунок 1. Схема эксперимента14ДЕЙСТВИЕ НА БЕЗЪЯДЕРНЫЕ КЛЕТКИ КРОВИ ЖИВОТНЫХ IN VITROОсобенности воздействия УЗ на тромбоциты. Для определения механизмоввоздействия УЗ на форменные элементы крови была отработана методика одновременной глубокой окраски клеток. Разработанный метод позволил визуализироватьграницы тромбоцитов и одновременно увидеть изменения морфологии и цитологии всех клеток крови. При методической разработке использовали импульсныйи модулированный УЗ, интенсивность 0.05–0.7 Вт/см2 и время воздействия 15–35 с(патенты РФ RU 2589679 и RU 2589680).

При несущей частоте 0.88 МГц диапазон νм 10–30 Гц и 800 Гц, при частоте генерации 2.64 МГц, ISATA = 0.4 Вт/см2 и tэксп15–30 с в импульсном режиме (10 мс) с последующим приготовлением мазкови окраской.Действие модулированного УЗ наэритроциты (рисунок 2) вначале вызываетанизоцитоз и пойкилоцитоз (появлениебулавовидных утолщений, наложений изменённых клеток крест-накрест («гантели»)) без внешних признаков разрушения или цитолиза, затем формированиегрупп вокруг клеток и цепочек. Возможнопоявление теней клеток.Рисунок 2. Эритроциты собаки.Выявлены видовые особенности взаиISATA = 0.4 Вт/см2, νм = 10 Гц, tэксп = 30 смодействия модулированного УЗ с клетками крови и самих клеток друг с другом. Облучение смеси крови животныхи смеси эритроцитов показали, что под действием УЗ вначале изменялись крупныеэритроциты и лейкоциты из смеси, причём направление взаимодействия одновременно было разнонаправленным «свой» — «чужой» и однонаправленным«свой» — «свой».

Некоторые примеры основных УЗ диапазонов и спектры активных частот, воздействующих на эритроциты разных видов животных: лошадь —интенсивность 0.05 Вт/см2, частота модуляции 100 Гц и 500 Гц; 0.4 Вт/см2, 10 Гц;0.4 Вт/см2, 800 Гц; 0.7 Вт/см2, 100 Гц; собака — 0.2–0.7 Вт/см2, 10–20 Гц; кошка —0.4–0.7 Вт/см2, 800 Гц и 0.7 Вт/см2, 10 Гц. Время экспозиции для всех животных —в пределах 30–60 с.15ДЕЙСТВИЕ НЕПРЕРЫВНОГО И ИМПУЛЬСНОГО УЛЬТРАЗВУКА НА ЛЕЙКОЦИТЫ.

МИНИМАЛЬНЫЙПОРОГ ДЕЙСТВИЯИзучен клеточный ответ на действие минимальной применяемой в терапииУЗ интенсивности 0.05 Вт/см2, от 15 до 35 с, и выявлена зависимость «доза–эффект» лейкоцитов здоровых и больных животных, а также воздействия на лейкоциты в зависимости от возраста животных (таблицы 2, 3). Полученные результатыотражают пороговое биологическое воздействие непрерывного УЗ на клетки крови.Таблица 2. Изменение лейкограммы здоровых собак после УЗ обработки интенсивностью0.05 Вт/см2 (M ± m, p < 0.05)КонтрольISATA = 0.05 Вт/см2; tэксп = 15 с ISATA = 0.05 Вт/см2; tэксп = 30 с1 гр. 2 гр.

3 гр. 4 гр.1 гр.2 гр.3 гр.4 гр.1 гр.2 гр.3 гр.4 гр.4.0±0.23.0±0.26.0±0.21.0±0.24.3±1.72.9±0.64.4±1.00.9±0.62.4±0.81.6±0.73.7±1.40.7±0.75.13.14.01.04.32.14.61.84.95.44.71.6±0.2±0.2±0.2±0.2±0.7±0.8±0.5±1.0±0.7±0.5±1.4±0.7Б0.3±0.11.0±0.101.1±0.100.4±0.10.4±0.10.7±0.10.3±0.10.5±0.10.4±0.11.0±0.1Л23.3±0.227.2±0.242.3±0.241.2±0.224.1±1.028.6±1.346.0±1.350.0±1.238±445±452±655±5П7.1±0.32.1±0.33.1±0.36.3±0.36.3±0.71.6±0.52.4±0.55.3±0.75.6±0.82.4±0.52.6±0.86.2±1.0С61.5±0.364.1±0.345.2±0.349.1±0.361.0±1.264.4±1.442.1±1.742±248±441±536±435±4Э1МНТаблица 3. Изменение лейкограммы здоровых кошек после УЗ обработки интенсивностью0.05 Вт/см2 (p < 0.05, M ± m)Контроль1ISATA = 0.05 Вт/см2; tэксп = 15 с ISATA = 0.05 Вт/см2; tэксп = 30 с1 гр. 2 гр.

3 гр. 4 гр.1 гр.2 гр.3 гр.4 гр.1 гр.2 гр.3 гр.4 гр.Э4.0±0.23.0±0.26.0±0.23.0±0.23.3±0.53.1±0.94.7±1.42.0±1.02.8±0.91.7±0.73.7±1.42.0±1.0М3.0±0.23.0±0.21.0±0.21.0±0.23.7±1.42.0±1.01.6±0.52.0±1.04.6±0.63.3±0.54.7±0.74.8±1.2Б0.5±0.11.0±0.10.3±0.11.0±0.100.5±0.10.5±0.10.4±0.10.3±0.10.4±0.100.4±0.1Л45.0±0.247.0±0.242.0±0.241.0±0.247.5±1.848.7±1.945.0±1.540±349±250.1±1.647±364±2в лейкограммах: Б — базофилы, Л — лимфоциты, М — моноциты, Н — нейтрофилы: П — палочкоядерные, С — сегментоядерные; Э — эозинофилы, Ю — юные.16П6.0±0.32.0±0.33.0±0.36.0±0.35.5±0.53.0±2.02.5±0.55.0±1.06.4±1.02.3±0.52.8± 0.20С42.0±0.344.0±0.345.0±0.348.0±0.337.9±3.741.5±1.543.0±2.050.0±2.036.0±2.040.0±2.040.0±2.030.0±2.0НУстановлено постепенное увеличение процентного состава агранулоцитов,деформация и изменение проницаемости ЦПМ (p < 0.05).

Был сделан вывод о пороговом значении УЗ интенсивности и времени — 0.05 Вт/см2 и 30 с. Эффект,начинаясь с гранулоцитов, на всех видах лейкоцитов одновременно проявлялся привремени инсонации от 30 с и выше. Показано, что УЗ 0.05–0.1 Вт/см2 является «безопасным» для клеток крови здоровых животных, но изменяет лейкограммуи уменьшает число жизнеспособных клеток крови больных животных. Степень выраженности изменений зависит, главным образом, от интенсивности УЗ волны,времени экспозиции и состояния здоровья. Этиология заболевания на особенностиклеточного ответа не влияет. При увеличении экспозиции до 2.0 Вт/см2 и 1–5мин — отмечен каскадный, прогрессивно возрастающий цитоцидный эффект:«съёживание» клеток, появление клеточных фрагментов, участков из оформленныхбелковых масс или нетипируемых клеток, лизис и скопление голоядерных элементов.

У здоровых животных подобные изменения регистрировали при 0.2 Вт/см2и времени от 20 с. Направленно изменить лейкограмму больных животных можнонепрерывной УЗ волной (0.88 МГц), интенсивностью от 0.05 до 0.1 Вт/см2 от 15 сдо 30 с, что приводит к уменьшению числа лимфоцитов и изменению числа нейтрофилов. Результат является диагностическим критерием при выявлении различныхпатологических состояний животных (патент РФ на изобретение RU 2574881).С ростом интенсивности УЗ до 0.7 Вт/см2 в крови всех видов животных регистрировали разрушение эозинофилов и базофилов, выход гранул в межклеточное пространство, агрегацию сегментоядерных нейтрофилов, что, совместно с даннымитеста с трипановым синим на неповреждённых клетках, свидетельствует о направленном влиянии на ЦПМ.

С увеличением времени экспозиции идёт лизис ЦПМ,вакуолизация эритроцитов и увеличение абсолютного количества моно– и лимфоцитов.Особенности действия импульсного УЗ выявляли, используя кровь лошадей,что обусловлено возможностью уменьшения тепловой компоненты в бо́льшем объёме отбираемой крови.

Клеточный ответ регистрировали после 20 с облучения,17начиная с изменений нейтрофилов и эозинофилов (при 0.4 Вт/см2). При увеличении времени опыта до 30–60 с отмечено изменение проницаемости ЦПМ тромбоцитов, деформация ЦПМ эритроцитов. При росте интенсивности до 0.7–1.0 Вт/см2дегенеративные изменения нарастали и завершались цитолизом.Результатами регрессионного и корреляционного анализа между изменениями физиологического состояния клеток — экспозицией УЗ и жизнеспособностьюклеток крови — показано наличие тесных (|r| > 0.69) и средних (0.3 < |r| < 0.69) отрицательных корреляционных связей у собак, у кошек и у лошадей (p < 0.001).Следовательно, морфологические изменения лейкоцитов связаны с дозой непрерывного УЗ воздействия, происходящих на фоне уменьшения жизнеспособности.Математические закономерности изменения жизнеспособности лейкоцитов после3 мин обработки непрерывным УЗ подтвердили это заключение.

При времени от 5до 60 с процент жизнеспособности в зависимости от УЗ интенсивности уменьшается экспоненциально (r = 0.990, S = 2.31).ВЛИЯНИЕ АМПЛИТУДНО-МОДУЛИРОВАННОГО УЛЬТРАЗВУКА НА КЛЕТКИ КРОВИ.ВНУТРИВИДОВЫЕ И ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИИзучено УЗ действие на клетки крови здоровых МДЖ, лошадей, смеси кровиживотных. Физиологические изменения клеток крови животных разного возрастазависели от энергии УЗ волны и частоты.

Степень лейкопении и лимфоцитоза, состояние ядра и ЦПМ связаны с параметрами инсонации (ISATA и νм). На основанииполученных результатов нами предложены способы направленного акустическоговоздействия на функциональное состояние клеток тканей представителей семейства кошачьих, собачьих и непарнокопытных (заявки № 2016116741;№ 2016127403; № 2016137363). Доказана реальность планового воздействия УЗволной на клетки разных типов и размеров, изменяющего проницаемость/структуру ЦПМ и ядерной мембраны, регулирующего глубину УЗ эффекта, направленноразрушающего в одной ткани ядра клеток требуемого размера; возможность задавать направленную супрессию роста клеток, регулировать активность внутриклеточных и мембран-связанных ферментов.

Получаемые эффекты указывают на возможность проводить купирование заболеваний различной этиологии на клеточномуровне и оценивать индивидуально репарационную систему клетки.В результате исследования изменения клеток крови собак под действием модулированного УЗ установлено, что наиболее выраженный клеточный ответ возникает при инсонации вблизи частот модуляции, кратных 10 и далее 100 Гц.18При изучении воздействия амплитудно-модулированного УЗ на клетки кровилошадей выявлено (p < 0.05), что 30-секундное облучение с модуляцией 250 Гц,ISATA = 1.0 Вт/см2, изменяет процентное соотношение клеток: рост абсолютногои относительного числа моноцитов и лимфоцитов и уменьшение количества гранулоцитов. Наиболее сильно по сравнению с контролем и с непрерывным УЗ лейкограмма изменялась при частотах модуляции 1000 Гц и 520 Гц.