Автореферат (Функциональное состояние клеток при действии ультразвуковых волн (биохимические и физиологические аспекты))

на правах рукописиОЛЕШКЕВИЧ Анна АнатольевнаФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТОКПРИ ДЕЙСТВИИ УЛЬТРАЗВУКОВЫХ ВОЛН(БИОХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ)Специальность:03.01.04 — Биохимия03.03.01 — ФизиологияАвтореферат диссертации на соискание учёной степенидоктора биологических наукМОСКВА, 2017 г.Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — МВА имени К. И.

Скрябина» (ФГБОУ ВОМГАВМиБ — МВА имени К. И. Скрябина).Научные консультанты:Академик РАН, доктор ветеринарныхнаук, профессорВасилевич Фёдор ИвановичДоктор биологических наук, профессорИпполитова Татьяна ВладимировнаОфициальные оппонентыДерхо Марина Аркадьевна, профессор, доктор биологических наук, заведующая кафедрой органической, биологической и физколлоидной химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «ЮжноУральский государственный аграрный университет»;Каширина Лидия Григорьевна, профессор, доктор биологических наук, заведующаякафедрой анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных Федеральногогосударственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования«Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.

А. Костычева»Ярован Наталья Ивановна, профессор, доктор биологических наук, заведующая кафедрой биохимии и кормления животных Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Орловский государственный аграрный университет имени Н. В. Парахина».Ведущая организация — Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимиии питания животных».Защита диссертации состоится «___» _________ 2017 г. в ______ на заседаниидиссертационного совета Д 220.042.04 при ФГБОУ ВО МГАВМиБ — МВА имениК.

И. Скрябина: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23. Телефон: (495) 37791-17, факс: (495) 377-49-39.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и на официальномсайте ФГБОУ ВО МГАВМиБ — МВА имени К. И. Скрябина http://www.mgavm.ru.Автореферат разослан «___» _________ г.Учёный секретарь диссертационного советаВ.

Д. ФоминаОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯУльтразвуковые методы являются неотъемлемой частью комплексного диагностического обследования животных и человека, что определяет актуальностьизучения их физиологического воздействия на биологические объекты.Известно [Luo W, 2007; Хамитова Г. В., 2011], что ультразвук (УЗ) с используемыми в физиотерапии частотами 45 кГц, 1 и 3 МГц стимулирует внутриклеточные и молекулярные процессы, задействованные в реакциях воспаления и ранозаживления.

Существуют практические руководства по частоте, интенсивности УЗ,времени обработки или количеству процедур при лечении многих заболеваний. Однако отсутствуют, особенно в ветеринарии, физиологические и биохимические основы безопасной физиотерапии, исключающей деструктивные побочные эффектыданного воздействия, что определило направление наших исследований.Актуальность исследования состоит в том, что в физиотерапии не определены спектры действия активных частот для разных тканей домашних животныхпри использовании модулированного УЗ. Необходимо знать эффективностьи определить биохимические и физиологические механизмы изменения организмав целом, тканей и отдельных клеток при применении УЗ воздействия.Для различных физических факторов воздействия (электромагнитных и акустических) было отмечено, что модулированные волны могут оказывать болеесильное воздействие, чем непрерывные [Утешев В.

К., 2010]. Модуляционное, посравнению с непрерывным, воздействие на биологические системы разного уровняорганизации вызывает ответы при уровнях энергии намного меньших. Когда непрерывное воздействие является (под)пороговым, амплитудно-модулированныйУЗ может инициировать более сильные стимулирующие или тормозящие эффекты.Это позволит достичь существенного снижения уровня отрицательного воздействия и уменьшить тепловое и кавитационное действие УЗ на органы и ткани приисследовании и терапии животного, тем самым увеличивая эффективность метода.При УЗ терапии и диагностике всегда основным объектом воздействия являются клетки крови.

Экспериментальные данные динамики изменения физиологического состояния клеток крови в поле непрерывной бегущей и амплитудно-модулированной УЗ волны позволят определять интенсивность, временные интервалы3и диапазоны частот ингибирования или активирования внутриклеточных процессов. Установленные физиологические и биохимические изменения клеток помогают выявлять безопасные для организма диапазоны.Исследования по определению физиологических и биохимических аспектовнепрерывного, импульсно– и амплитудно-модулированного акустического воздействия позволят разработать комплексную стратегию клинического использованиятерапевтического УЗ различной частоты в диагностике и терапии.СТЕПЕНЬ РАЗРАБОТАННОСТИ ТЕМЫНами проведено изучение и анализ экспериментальных и теоретических исследований, проработано 227 отечественных и 183 зарубежных источника.

Исследователями установлена возможность разнонаправленного действия УЗ [Botyan N,1989]. Установлено, что в УЗ поле могут возникать градиенты скорости, а объектыоблучения подвергаться действию сдвиговых напряжений. Методом гемолизаэритроцитов в суспензии in vitro [Хилл К, 2008] было доказано, что высокие сдвиговые напряжения в акустических течениях повреждают биологические ткани.

Отмечено повреждение эндотелия в кровеносных сосудах эмбрионов цыплят и маткимышей в месте контакта жидкости с оболочкой сосуда.В зависимости от интенсивности и времени воздействия наблюдали активацию и подавление функционального состояния клеток, вплоть до их повреждения[Журавлёв А. И., 2015; Акопян В. Б., 2016], что сопровождалось изменением электрокинетических потенциалов клеток, систем активного и пассивного транспортаионов через клеточные мембраны и их структурными перестройками, а также изменением биохимического состава крови [Orlowska E, 1980; Miller DL, 1995; Акопян В. Б., 2016]. Биологические эффекты УЗ многофакторны, а клеточный откликна воздействие зависит от концентрации клеток [Brayman AA, 1996]. Проявлениемеханизма биологического действия зависит от интенсивности УЗ и времени воздействия [Кузнецов В.

П., 1987; Пашовкин Т. Н., 2010; Утешев В. К., 2010]. Привоздействии акустических волн на живую клетку происходит изменение её функционального состояния, что проявляется изменением поверхностного заряда вследствие последовательного сжатия и разрежения цитоплазматических мембран(ЦПМ). Это как уменьшает, так и увеличивает количество активных каналов засчёт латеральной диффузии молекул липидного бислоя и может значительно изменить физиологическое состояние клетки [Пашовкин Т.

Н., 1990; Акопян В. Б.,2016]. Указанные механизмы определяют интерес по выяснению процессов, про4ходящих на уровне клеток, после УЗ воздействия in vitro и in vivo. Однако в литературных источниках данные о взаимодействии непрерывного и модулированногоУЗ с подвижной тканью организма животного — кровью — или отсутствуют вовсеили представлены недостаточно. Также не указаны спектры опасных и безопасныхчастот модуляции при работе с УЗ терапевтических интенсивностей.Таким образом, недостаточная научная разработанность означенной проблемы и то существенное значение, которое она приобретает для ветеринарной медицины, определяют актуальность темы, цель и задачи диссертационного исследования.ЦЕЛИ И ЗАДАЧИЦель исследования — изучить физиологические и биохимические эффектывоздействия УЗ на клетки и организм животных для характеристики разнонаправленных изменений указанных систем.Для реализации указанной цели были поставлены задачи:1) изучить влияние непрерывного и модулированного УЗ на клетки бактерий;2) изучить влияние непрерывного и модулированного УЗ на клетки археи;3) исследовать влияние in vitro непрерывного и модулированного УЗ на клеткикрови здоровых животных в зависимости от вида клеток и вида животных;4) провести исследования по изучению особенностей влияния in vitro непрерывного и модулированного УЗ на клетки крови больных и инвазированных животных;5) изучить действие модулированного УЗ на продукцию интерферона (ИФН) лейкоцитами;6) изучить влияние непрерывного и модулированного УЗ на активность ферментовкрови разных видов животных;7) провести испытания влияния in vivo модулированного УЗ на целый организм.НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ1.

Впервые в качестве воздействующего фактора на клетки крови различныхживотных применён амплитудно-модулированный УЗ и изучено его влияние.Впервые из акустического спектра действия экспериментально найдены частотымодуляции УЗ волн для активного облучения (инсонации) конкретных биологических систем, позволяющие при равноэнергетическом воздействии получать биологические эффекты разного знака и амплитуд для разных частот модуляции.2. Установлено, что воздействие модулированных УЗ волн терапевтическогодиапазона интенсивностей с частотой модуляции от 0.10 до 1000 Гц и временем5экспозиции от 10 с до 5 мин может оказывать стимулирующее, тормозящее илиразрушающее воздействие на клетки.

Определены диапазоны, оказывающие этиэффекты. Впервые выявлена особая чувствительность эритроцитов и нейтрофилов,содержащих внутриклеточных паразитов (бабезии), к воздействию модулированного УЗ.3. Впервые показано однонаправленное стимулирующее действие непрерывного и амплитудно-модулированного УЗ на клетки люминесцирующих бактерий,архей, лейкоциты, сперматогенные клетки и выявлены оптимальные режимы воздействия: интенсивность (средняя по пространству и времени интенсивность ISATA),время экспозиции (tэксп) и диапазоны активных частот модуляции (νм).3.1.

Стойкий стимулирующий эффект на эмиссионную активность фотобактерий вызывает трёхминутное облучение непрерывным УЗ интенсивности 0.2–0.4 Вт/см2, амплитудно-модулированным — из диапазона частот 85–100 Гц при0.2 Вт/см2, а также 10–12 Гц при 0.4 Вт/см2.3.2. Стимулирующее воздействие на клетки архей оказывает УЗ интенсивностью 0.4 Вт/см2 частотой 0.25–0.7 Гц.3.3.

Стимулирующее действие на лейкомассу оказывает УЗ интенсивностью0.05 Вт/см2, частотой модуляции 800 Гц в течение 30 с — 1 мин, на сперматогенные клетки — 1.0 Вт/см2, частотой модуляции 250 Гц в течение 5 мин.4. Впервые на клетках крови, культурах микробных клеток: бактерийAliivibrio fischeri 6, архей Halobacterium halobium 1001 (H.