Диссертация (Изучение роли последовательностей, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжей saccharomyces cerevisiae), страница 2

К настоящему времени показано, чтоболее30заболеванийчеловека,многиеизкоторыхнеизлечимы,ассоциировано с образованием амилоидов (по: Sipe et al., 2014). Однако,сравнительно недавно было показано, что амилоидогенез связан не только спатологией, но и играет существенную роль в физиологических процессах усамых разных организмов (по: Nizhnikov et al., 2015).

Так, амилоидынеобходимы для формирования биопленок у бактерий (Chapman, 2002) и архей(Chimileski et al., 2014), воздушных гифов у грибов (Wösten and Vocht de, 2000),запасания гормонов (Maji et al., 2009) и синтеза меланина (Fowler et al., 2006)у человека, а также вовлечены в еще целый ряд процессов. Стоит отметить,что список функциональных амилоидов продолжает постоянно расширяться.Важным этапом в изучении амилоидов было открытие инфекционныхамилоидов – прионов (Bolton et al., 1982), изначально выявленных умлекопитающих, но позже обнаруженных у одноклеточных грибов – дрожжейSaccharomyces cerevisiae (Wickner, 1994).

Последовательности подавляющегобольшинства дрожжевых прионных белков содержат участки, богатыеаспарагином (N) и глутамином (Q). Показано, что эти участки необходимы дляформирования амилоидных фибрилл и эволюционно консервативны (An et al.,2016; Toombs et al., 2010). Известно, что наличие амилоидных агрегатоводного белка может провоцировать агрегации других белков, или иначе говоряпровоцируюткросс-индукциюамилоидогенеза.Механизмытакихвзаимодействий изучены недостаточно. Богатые аспарагином и глутаминомучастки белков также вовлечены в кросс-индукцию амилоидогенеза (Derkatch7et al., 2001; Derkatch et al., 2004), однако влияние аминокислотного состававзаимодействующих белков на этот процесс не ясны.Настоящее диссертационное исследование посвящено изучению ролиучастков, богатых аспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза намоделях прионного домена белка Sup35 (Ter-Avanesyan et al., 1994) и NQобогащенного участка транскрипционного фактора Gln3 (Alberti et al., 2009).Поскольку кросс-индукция амилоидогенеза зачастую связана с развитиемпатологий, исследование актуально как с фундаментальной, так и сприкладной точки зрения.Степень разработанности темыНа текущий момент накоплен значительный объем данных о прионахдрожжей (по: Nizhnikov et al., 2015), структуре амилоидов (по: Riek, 2016),роли богатых аспарагином и глутамином участков в амилоидогенезе (Derkatchet al., 2004; Toombs et al., 2010), а также о взаимодействии некоторыхдрожжевых прионов (Derkatch et al., 2001).

В то же время, рольаминокислотного состава белков в регуляции индукции амилоидогенеза наданный момент изучена недостаточно хорошо. Получение новых данных овлиянии богатых аспарагином и глутамином амилоидов на агрегацию другихбелков в масштабах всего протеома имеет фундаментальное и потенциальноприкладное значение.Цель и задачи исследованияЦелью работы является изучение роли последовательностей, богатыхаспарагином и глутамином, в индукции амилоидогенеза у дрожжейSaccharomyces cerevisiae.В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:81. Провести сравнительный анализ амилоидогенных свойств нативного Nдомена Sup35 и его модифицированных вариантов, у которых всеглутаминовыеостаткизамещенынааспарагиновыеилифенилаланиновые.2.

Выявить в протеоме дрожжей белки, агрегация которых индуцируется вприсутствии нативного N-домена Sup35 и его модифицированноговарианта, у которого все глутаминовые остатки замещены нааспарагиновые.3. Охарактеризовать влияние прионов [PSI+] и [PIN+] на агрегациюбогатого аспарагином и глутамином домена белка Gln3.Научная новизнаВ ходе данной работы впервые были изучены амилоидные свойства двухвариантов N-домена белка Sup35, у которых все остатки глутамина замещенына остатки аспарагина или фенилаланина. Также изучена способность этихвариантов индуцировать фактор [PSI+]. Показано влияние аминокислотногосостава на взаимодействие амилоидогенных белков.

Выявлен ряд белков,агрегация которых индуцируется сверхпродукцией нативного N-домена Sup35и его модифицированного варианта, у которых все глутаминовые остаткизамещенынааспарагиновые.последовательностей,богатыхРазработанновыйаспарагином иалгоритмглутамином,inпоискаsilico.Охарактеризованы амилоидоподобные свойства олигомеров белка Mad1.Показано влияние прионов [PSI+] и [PIN+] на агрегацию богатого аспарагиноми глутамином домена белка Gln3.Теоретическая и практическая значимость работыПолученные в ходе данной работы результаты вносят вклад в пониманиемеханизмов индукции и регуляции амилоидогенеза.

Впервые показано, что9сходство аминокислотного состава амилоидогенных трактов влияет на кроссиндукциюамилоидогенеза.Установлено,чторазличиесвойстваминокислотных остатков в составе амилоидогенных трактов препятствуетвзаимодействию белков. Показано, что замены глутамина на аспарагинусиливают способность прион-формирующего белка индуцировать агрегациюдругих белков. Выявление закономерностей, определяющих «каскадыамилоидогенеза» в перспективе может иметь важное значение для разработкиподходов к лечению амилоидных заболеваний.Методология и методы исследованияВходевыполненияработыбылииспользованыстандартныегенетические и молекулярно-биологические методы исследований.

Былиспользован широкий ряд молекулярно-генетических методов (генноинженерные методы клонирования генов и конструирования плазмид,полимеразная цепная реакция, трансформация дрожжевых и бактериальныхклеток), методы флуоресцентной микроскопии, выделения белка, белковогоэлектрофореза в полиакриламидном и агарозном геле, Вестерн-блот и рядстатистических методов.

В исследовании был применен разработанный накафедре генетики и селекции СПбГУ метод протеомного скрининга иидентификацииамилоидовсиспользованиемвысокоэффективнойжидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией, а такжеразработан и применен биоинформатический алгоритм для выявленияучастков белков, обогащенных аспарагином и глутамином.Положения, выносимые на защитуНа основании экспериментов по замене аминокислотных остатков вприонном домене белка Sup35 мы показали, что сходство свойстваминокислотных остатков в составе взаимодействующих амилоидогенных10последовательностей является важным фактором для кросс-индукцииамилоидогенеза. Установлено, что замена глутамина на аспарагин вамилоидогенныхтрактахпоследовательностейРазработанныйнамиприводитиндуцироватькусилениюспособностиамилоидогенезбиоинформатическийалгоритмдругихдляэтихбелков.выявленияпоследовательностей, обогащённых амилоидогенными аминокислотами,существенно превосходит имеющиеся аналоги по скорости работы.Степень достоверности и апробация результатовПолученные в ходе данной работы результаты являются достоверными,что подтверждается публикацией в 4 научных статьях в рецензируемыхжурналах и 6 тезисных сообщениях.

Материалы работы были представленына ряде российских и международных конференциях: «Всероссийскаяконференциясмеждународнымучастием,посвященная50-летиюВавиловского (ранее Всесоюзного) Общества генетиков и селекционеров»,(2016, Москва, Российская Федерация); “International Symposium on CognitiveSciences, Genomics and Bioinformatics” (CSGB 2016) (2016, Новосибирск,Российская Федерация); международный конгресс “Prion 2016” (2016, Токио,Япония); “27th International Conference on Yeast Genetics and MolecularBiology” (2015, Левико-Терме, Италия); «VI Съезд Вавиловского Обществагенетиков и селекционеров (ВОГиС) и ассоциированных генетическихсимпозиумов» (2014, Ростов-на-Дону, Российская Федерация); “ The NinthInternational Conference on Bioinformatics of Genome Regulation andStructure/Systems Biology” (BGRS-2014) (2014, Новосибирск, РоссийскаяФедерация).113 Обзор литературы. Амилоиды и их взаимодействие3.1 Определение термина «амилоид»Внастоящеевремяамилоидыявляютсяобъектомактивныхисследований, и число работ в этой области неуклонно растет.

Количествостатей, публикуемых в год по этой теме и индексированных базой данныхPubMed (https://pubmed.com/), выросло с 2000 года в более чем три раза.Несмотря на это, до сих пор не существует строго и однозначного определениятермина «амилоид». С точки зрения современной биофизики под амилоидамипонимают неразветвленные белковые фибриллы, которые содержат регулярноповторенные β-цепи, перпендикулярные оси фибриллы, и формирующиемежмолекулярный кросс-β-слой (по: Greenwald and Riek, 2010).

В то же времясуществуют и другие трактовки этого термина. К примеру, в медицинеамилоиды определяют как белковые внеклеточные фибриллы, связывающиеспецифичные красители и вызывающие заболевания, известные какамилоидозы (по: Sipe et al., 2014). В рамках данной работы мы будемпридерживаться биофизического определения амилоидов. Важно отметить,что понимание природы амилоидов и их значения кардинально менялось входе развития науки и методов исследования (по: Nizhnikov et al., 2015).3.2 История формирования представлений об амилоидах3.2.1 Описание заболеваний, связанных с амилоидамиПервые упоминания о заболеваниях, связанных с амилоидозамипоявились относительно давно, много раньше, чем было возможно открытиесамих амилоидов.