Отзыв официального оппонента (Роль HIF1-зависимой регуляции пентозофосфатного пути в обеспечении реакций мозга на гипоксию)

Отзыв официального оппонента Кировой !Одни Игоревны на диссертационную работу Ветрового Олега Васильевича «РОЛЬ Н1Е1-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИЙ ПЕНТОЗОФОСФАТНОГО ПУТИ В ОБЕСПЕЧЕНИИ РЕАКЦИЙ МОЗГА НА ГИПОКСИ1О»ч представленную на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.01.04-Биохимии Актуальность темы диссертации Цереброваскулярные и нейродегенеративные патологии являются острой медико-социальной проблемой. поскольку в последние годы отмечается прогрессирующее увеличение количества случаев острых и хронических нарушений мозгового кровообращения, их «ранней» манифестации в возрасте до 45 лет, инвалидизации.

смертности (К1взе1а В.М. е! а!., 2012: Бпэа)!огас О., 2015). Решение проблемы ишемических повреждений мозга предполагает разработку. с одной стороны, подходов предупреждения циркулятор ной недостаточности мозга и, с другой, приемов купирования постпшемических нарушений. Изучение молекулярных патофизиологических механизмов снижения адаптивного потенциала мозга привело к формированию представления, согласно которому одним из триггерных патогенетических звеньев церебральной ишемии является снижение активности гипоксического фактора транскрипции Н!Г! !)эурох)а-!пас)йе Ыог 1) 1Согге)а э.С., 2010). Н1Г1 модулирует активность 1-5'~о генома. Патгерны активируемых генов различаются в разных тканях и клеточных типах, тем не менее.

существуют универсальные мишени активности Н1Г1 — гены 'ЛЗОГ. ферментов гликолиза, транспортеров глюкозы. Нейропротекторные эффекты Н!Г1 связаны с активацией генов эритропоэтина, ангиопоэтина„ 1ОГ2, которые детерминируют развитие механизмов толерантности нервной ткани к кислородной недостаточности. Именно дефицит активности Н1Г1. который усугубляется с возрастом, рассматривают как ключевой патогенетический триггерный механизм, ответственный за изреживание сосудистой сети мозга, снижение антиоксидантного и пролиферативного потенциала ткани мозга. Ингибирование пролилгидроксилаз и Н!Г1а-УН).-взаимодействий малыми молекулами-и нгцб иторами составляет основу перспективных направлений в терапии ишемических состояний ~Беженка 6.Е., 2004).

Современная базисная терапия постишемических нарушений включает стандартный комплекс тромболитических. антиоксидантныхзантигипоксических, противовоспалительных препаратов. Представленное О.В. Ветровым диссертационное исследование предлагает н доказывает правомочность нового подхода в коррекции постишемических нарушений — применение эффективной схемы гипоксического посткондиционирования (короткий курс из трех ежедневных 2-часовых воздействий умеренной гипобарической гипоксией) в сочетании с ингибитором активности Н1Г !.

Новизна проведенных исследований и полученных результатов В диссертационном исследовании О.В. Ветрового впервые показано существование отрицательной регуляции экспрессии глюкозо-б-фосфат дегпдрогеназы (Г6ФДГ) -- ключевого скоростз -лимитирующег о фермента пентозофосфатного пути (ПФП) — со стороны Н1Г1 и причастность Н!Г! в условиях тяжелой гипоксии к активации процессов свободнорадикального окисления и апоптоза.

Таким образом, работа Ветрового О.В. раскрывает новые аспекты Н1Г1-зависимых натогенетических механизмов. инициируемых тяжелой гип оке ней/ишемией. Вопрос о патогенетических сторонах активности Н1Г1 является одной из краеугольных тем последних нескольких десятилетий в области исследований канцерогенеза. перинатальных поражений мозга. нейродегенеративных патолоп1й, сердечно-сосудистой недостаточности.

Механизм переключения активности транскрипционного фактора Н!Г1 с проадаптивной (рговцгъ Ь а!) на повреждающу1о (ргос!еа!!з) остается наименее изученным аспектом знаний о Н1Г1. Известно, что Н1Г1 активирует гены проапоптотических факторов (Вь((РЗ, Х1Х, ХОХЛ: Бапс1ац апд Наяда, 2007), провоспалительных факторов (р53; Ей!!ш! е! а!.. 2006:, !МОЯ.

СОХ-2; Кззп е! а1„2007; М! е! а1., 2007). каспаз (каспаза-З, каспаза-9; Мз!н)уаша е1 а!., 2001; 1.ш е! а1.. 2002), Таким образом, вовлеченность Н1Г1 в механизмы клеточной гибели —. факт. доказанный на разных моделях независимыми лабораториями. Относительно механизма переключения рговцгйма!/ргодеа1!з активности Н1Г1 можно лишь предположить, что в условиях тяжелой гипоксии, сопряженной с знергодефицитом и окислптельным стрессом оказываются несостоятельными АТФ-зависимые механизмы антиапоптотической системы, эффективно блокирующей апоптоз в условиях слабой и умеренной гппоксни (в частности.

подавля~тся антнапоптотическая активность оелков теплового шока). В работе Ветрового О.В, впервые обосновывается применение ингибигора Н1Г1 как неотъемлемого элемента коррекции постишемических)постгипоксическнх нарушений 1активации апоптоза и воспаления) в мозге, Впервые показано, что Н1Г1 причастен к снижению интенсивности пентозофосфатного пути — главного источника НАДФН в мозге необходимого в поддержании пула восстановленного глугатиона и эффективности глутатион-зависимых антиоксидантных механизмов. Автор доказывает вовлеченность Н1Г1 в условиях тяжелой гипоксии в механизмы окнслительного повреждения клеток мозга.

В целом при ознакомлении с диссертацией возникает представление о необходимости ингибирования Н1Е1 в раннем постишемическом периоде с целью подавления прооксидантных. проинфламатнвных и проапоптотических механизмов. Считаю, что концептуальная основа диссертации Ветрового О.В. и полученные автором результаты инновационны, актуальны, представляют несомненную ценность для фундаментальной биолого-медицинской науки и практической медицины. Теоретическая и практическая значимость полученных автором результатов Диссертационное исследование О.В.

Ветрового существенно дополнило теоретические представления о механизмах развития окислительного стресса в условиях тяжелой гипоксии)ишемии. Автор доказал, что в условиях критического снижения обеспеченности мозга кислородом подавляется экспрессия гена ГбФДГ 1ключевой скорость-лимитирующий фермент ПФП), в результате чего снижается скорость НАДФН-зависимого восстановления глутати она и эффективность глугатион-сопряженных механизмов антиоксидантной защиты мозга.

Показана причастность Н1Г1 к супрессии гена Г6ФДГ. Основные результаты диссертации О.В. Ветрового — инлукция Вс1-2 в условиях гипоксического посткондиционирования и блокирование отсроченного апоптоза с помощью ингибитора Н!Г1 — имеют высокую практическую значимость, поскольку, наряду с другими активно разрабатываемыми в настоящее время подходами (ингибирование касггаз„применение антагонистов глутаматных рецепторов и индукторов Вс1-2). составляют патогенетическое оооснование для формирования новых эффективных терапевтических стратегий модуляции интенсивности апоптоза при ишемии-реперфузии мозга.

Степень обоснованности и достоверности научных положений, выводов и рекомендаций, сформулированных в диссертации Обращаясь к экспериментально-методической доказательной стороне исследования, необходимо отметить, что диссертантом был использован широкий молекулярно-биологических. биохимических, арсенал современных физиологических, статистических методов и подходов, позволяющих считать полученные в работе данные достоверными и достаточными для сформулированных выводов. Модель тяжелой гипоксии. также как и схема гипоксического посткондиционирования, была многократно апробирована в исследованиях, проводимых в Институте физиологии имени И.П.

Павлова, представляет собой строго дозируемое по тяжести и продолжительности гипобарическое гипоксическое воздействие и не вызывает сомнений в отнгяпении стандартизации н воспроизводимости получаемых эффектов. Апоптоз автор оценивал двумя независимыми методами, применяя световую микроскопию (Т(ЗМЕ1.-метод) и электрофоретический анализ фрагментации ДНК, что позволило существенно повысить достоверность и надежность данных. принципиально значимых для формирования оригинальных научных положений, составлякпцих суть диссертационного исследования. Специфичность всех использованных в работе выл ител была проверена с помощью иммуноблотинга. При изучении окислительновосстановительного статуса мозга автором был использован комплексный многопараметрический подход, О.В, Ветровой проанализировал семь различных показателей, характеризующих интенсивность процессов свободнорадикального и перекисного окисления липидов (диеновые и триеновые конъюгаты полиненасыщенных липидов.

основания Шиффа, фосфолипиды, ТБК-реакгивные продукты) и редокс-статус (восстановленные тиоловые группы, общий глугатион) исследуемых областей мозга. Фермент ГбФДГ, составляюший главный фокус внимания исследователя, был изучен с безукоризненной тщательностью. Автор определял активность и экспрессию фермента на уровне транскрипции и трансляции. Таким образом, основные научные положения исследования, выносимые на защиту, и выводы диссертации обоснованы достаточным количеством достоверных экспериментальных данных. прошли успешную апробацию на многочисленных российских и международных конференциях (57 тезисов), полностью отражены в рецензируемых публикациях (! О статей).

Оценка содержании диссертации, ее завершенности Структура и оформление диссертации соответствуют традиционным стандартам и рекомендациям ВАК. Рукопись включает разделы «введение», «литературный обзор». «материалы и методы», «результаты и обсуждение». «заключение», «список литературы». Изложение материала выполнено четким и ясным академическим языком, стилистически и логически выверенным. При прочтении «введения» и «литературного обзора» формируется представление о современном уровне разработанности темы и существуюгцих пробелах.

В разделе «материалы и методы» дается подробное описание использованных методов. что указываег на глубокое понимание диссертантом базовых принципов и знание технических деталей использованной методологии. В разделе «результаты и обсуждение» последовательность изложения экспериментальных данных логична, описание результатов не вызывает вопросов и замечаний, иллюстративный материал информативен и достаточен.