Диссертация (Имидазолиевые ионные жидкости в качестве экстрагентов, модификаторов кварцевого капилляра и хиральных селекторов в капиллярном электрофорезе), страница 8

Оценка стабильности ковалентных покрытийОценка стабильности синтезированных покрытий при различныхзначениях рН осуществлялась по контролю скорости электроосмотическогопотока. Кварцевый капилляр перед каждым анализом последовательно58промывался в течение 5 мин дистиллированной водой и 10 мин фоновымэлектролитом (10 мМ при рН равном 2.0, 4.0, 5.6, 7.7, 9.3), затемгидродинамически (2с × 30 мбар) вводили 5 %-ный водный раствор ДМФА вводе (Рис. 24).Рис. 24. Зависимость скорости ЭОП от рН фонового электролита.Условия: система капиллярного электрофореза «Капель 105М», фоновыйэлектролит: 10 мМ NaH2PO4 (доведенный до требуемого значения рН 0.1 Мраствором HCl) или 10 мМ H3BO3 (доведенный до требуемого значения рН 0.1М раствором NaOH).

Напряжение ±20 кВ, детектирование – 220 нм. МаркерЭОПа – 5 %-ный (объемн.) раствор ДМФА в воде.При увеличении рН фонового электролита происходило уменьшениескорости ЭОП, а при рН равном 9.3 генерировался катодный ЭОП, чтоуказывает на наличие остаточных силанольных гидроксильных групп наповерхности кварцевого капилляра. После работы в щелочной среде и привозращении к рН = 2.0 восстанавливался анодный ЭОП.

При рН > 7.0количество анализов сокращается с 150 до 10.59II.2. Методы исследованияII.2.1. Высокоэффективная хроматография стероидных гормонов иаминокислотХроматографическое разделение стероидных гормонов и аминокислотосуществлялось с целью определения степеней извлечения аналитов из воднойфазы в гидрофобные ионные жидкости (C6MImNTf2, C6MImBF4, C8MImBF4).II.2.1.1. Условия хроматографического разделения аминокислотРабота выполнялась на жидкостном хроматографе «Series 1200»(«Agilent Technologies»), колонка «Eclipse Plus C18» (4,6*100 мм, 3,5 мкм) ссоответствующей предколонкой.Подвижная фаза: ацетонитрил-вода, градиентный режим элюирования;диодно-матричный детектор.

Температура колонки и детектора: 30 ºС. Скоростьпотока – 0.6 мл/мин, ввод пробы – 20 мкл, Время анализа – 12 мин.Градиент: 0 мин – 2% CH3CN, 3 мин – 20% CH3CN, 6 мин – 50% CH3CN,7 мин – 2% CH3CN. λ=270 нм.60TrpDOPA TyrРис. 25. Хроматограмма стандартного раствора аминокислот.Аналиты: DOPA – 3,4-дигидроксифенилаланин, Tyr – тирозин, Trp –триптофан.

Условия см. в II.2.1.1.II.2.1.2. Условия разделения стероидных гормонов методом ВЭЖХОборудование: жидкостныйхроматограф«Series 1200» («AgilentTechnologies»), колонка «Eclipse Plus C18» (4,6*100 мм, 3,5 мкм) ссоответствующей предколонкой.Подвижная фаза: ацетонитрил-вода, градиентный режим элюирования;диодно-матричный детектор. Температура колонки и детектора: 30ºС. Скоростьпотока – 0.2 мл/мин, ввод пробы – 20 мкл, Время анализа – 17 мин.Градиент: 0 мин – 50% CH3CN, 0.2 мл/мин; 6 мин – 80% CH3CN, 0.3мл/мин; 10 мин – 80% CH3CN, 0.3 мл/мин; 12 мин – 50% CH3CN, 0.2 мл/мин. λ=240 нм.61FEBSРис.

26. Хроматограмма стандартного раствора стероидных гормонов.Аналиты: F – кортизол, E – кортизон, B – кортикостерон, S – 11дезоксикортизон. Условия см. в II.2.1.2.Для оценки степеней извлечения стероидных гормонов из водной фазы впроцесседисперсионнойжидкостно-жидкостноймикроэкстракциииспользовалось следующее оборудование: жидкостный хроматограф «LC-30Nexera» («Shimadzu»), колонка «Luna C18 (2)» (3.0*150 мм, 3 мкм) ссоответствующей предколонкой.Подвижнаяфаза:ацетонитрил-вода,изократическийрежимэлюирования; диодно-матричный детектор.

Температура колонки и детектора:30ºС. Скорость потока – 0.3 мл/мин, ввод пробы – 20 мкл, Время анализа – 15мин. Подвижная фаза: 35% CH3CN. λ = 240 нм.62Рис. 27. Хроматограмма стандартного раствора стероидных гормонов.Аналиты: F – кортизол, E – кортизон, B – кортикостерон, S – 11дезоксикортизон. Условия см. в II.2.1.2.II.2.2. Электрофоретические экспериментыII.2.2.1. Подготовка капилляра к работеНовый кварцевый капилляр кондиционировали путем промывки 1 Мраствором NaOH в течение 20 мин, затем дистиллированной водой в течение 15мин при давлении 950-1000 мбар.

Между анализами капилляр промывали 0,1 Мраствором NaOH (при дальнейшем использовании боратного буфера) или 0,1 Мраствором HCl (для фосфатного буфера) в течение 2 мин, затем 3 мин водой и 5мин фоновым электролитом.II.2.2.2. Приготовление буферных растворов- фосфатный буферный раствор, 0.2 М. Для приготовления 50 млбуферного раствора взвешивали 1.56 г дигидрофосфата натрия (NaH2PO4•2H2O).Для получения требуемого значения рН к раствору добавляли 1М раствор HCl .63- боратный буферный раствор, 0.2 М. Для приготовления 50 млбуферного раствора взвешивали 0.62 г борной кислоты (Н3ВО3). Для получениятребуемого значения рН к раствору добавляли 2 М раствор гидроксида натрия.II.2.2.3. Условия электрофоретического разделенияУсловияэлектрофоретическогоразделенияаминокислотикатехоламинов при использовании ионных жидкостей в качестве динамическихмодификаторовФоновый электролит: 10 – 75 мМ фосфатный (рН = 2.0, доведенный дотребуемого значения 0.1 М раствором соляной кислоты) или боратный (рН =9.3) буферные растворы с добавкой ионных жидкостей (C12MImCl илиC16MImCl) или ЦТАБа (0-150 мМ).

Напряжение:20 кВ. Температуратермостатирования: 20 0С. Время ввода пробы: 3 – 20 с, давление ввода: 30-50мбар.Условия электрофоретического разделения стероидных гормонов врежиме МЭКХ при использовании ионных жидкостей в качествепсевдостационарных фаз.Фоновый электролит: 10 – 150 мМ фосфатный (рН = 2.0, доведенный дотребуемого значения 0.1 М раствором соляной кислоты) буферный раствор сдобавкой ионной жидкости C16MImCl (0.5-75 мМ), β-циклодекстрина (β-ЦД) (125мМ)илиДДСН(1-5)мМ.Напряжение:-20кВ.Температуратермостатирования: 20 0С.

Время ввода пробы: 3 – 20 с, давление ввода: 30-50мбар.64Условия хирального электрофоретического разделения энантиомероваминокислот с участием ионных жидкостей ряда [CnMIm][L-Pro] (n=2, 4, 8,12)Фоновый электролит: 10 – 100 мМ боратный (рН 7.0 - 13.0, доводили дотребуемого значения рН 2 М раствором гидроксида натрия) буферный раствор сдобавкой от 5 до 30 мМ [C4MIm][L-Pro] и 2.5-15 мМ CuCl2 или 10 мМ ZnSO4.Напряжение: +10-30 кВ. Температура термостатирования капилляра: 30 0С.Время ввода пробы: 5 с, давление ввода: 50 мбар.Условия разделения энантиомеров β-адреноблокаторовФоновый электролит: 20 мМ фосфатный (рН 2.0) буферный раствор сдобавкой 5 мМ 2-HP-β-CD и от 0 до 5 мМ [C4MIm][L-Pro].

Напряжение: +10-30кВ. Температура термостатирования капилляра: 30 0С. Время ввода пробы: 5 с,давление ввода: 50 мбар.Условия внутрикапиллярного концентрированиякатехоламинов на синтезированных покрытияхаминокислотиФоновый электролит: 10 мМ раствор NaH2PO4 (рН = 2.0, доведенный дотребуемого значения 0.1 М раствором соляной кислоты). Напряжение: -20 кВ.Температура термостатирования капилляра: 20 0С. Время ввода пробы: 2-100 с,давление ввода: 30-50 мбар.Условия on-line концентрирования аминокислот и катехоламинов насинтезированных покрытиях в режиме МЭКХФоновый электролит: 10 мМ раствор NaH2PO4 (рН = 2.0, доведенный дотребуемого значения 0.1 М раствором соляной кислоты), 5-75 мМ ДДСН,Напряжение: +20 кВ. Температура термостатирования капилляра: 20 0С. Время65ввода пробы: 2-100 с, давление ввода: 30-50 мбар или напряжение ввода пробы:10-20 кВ.Условия электрофоретического разделения стероидных гормонов врежиме МЭКХ при определении в образцах мочиФоновый электролит: 25 мМ раствор NaH2PO4 (рН = 2.0, доведенный дотребуемого значения 0.1 М раствором соляной кислоты), 25 мМ раствор ДДСН,5 М раствор мочевины.

Напряжение: -20 кВ. Температура термостатированиякапилляра: 20 0С. Время ввода пробы: 5 с, давление ввода: 50 мбар.II.3. Жидкостная экстракцияII.3.1. Экстракция аминокислот в ионные жидкостиII.3.1.1. Жидкостно-жидкостная экстракция аминокислот в ионныежидкости С6MImNTf2, С6MImBF4, С8MImBF4В пробирки типа Эппендорф вносили 25 мкл стандартных раствороваминокислот, 25 мкл 1 М раствора HCl, 900 мкл дистиллированной воды итщательно перемешивали.

Затем добавляли 100, 250, 500, 1000 мкл ионнойжидкости и ставили на 1 час в шейкер при температуре 30 0С (табл. 6).Расчет степеней извлечения осуществляли по формуле:Степень извлечения = 1 -Св,С0(3)где Св – концентрация аналита в водной фазе после экстракции (мкг/мл), С0 –начальная концентрация аналита (мкг/мл).66Таблица 6. Степени извлечения (%) аминокислот (25 мкг/мл) в ионныежидкости при различном соотношении фаз ИЖ:вода (объемн.) (n=3, p=0.95).Аналит1:103,4-ДигидроксифенилаланинТирозинТриптофан6±27±210±23,4-ДигидроксифенилаланинТирозинТриптофан6±27±213±23,4-ДигидроксифенилаланинТирозинТриптофан0±10±111±2Соотношение фаз ИЖ: вода, объемн.1:41:2C6MImNTf212±294±620±390±743±298±2C6MImBF412±318±220±533±343±769±7C8MImBF40±10±17±210±235±450±51:195±593±699±126±347±582±81±113±270±6II.3.1.2.

Жидкостно-жидкостная экстракция аминокислот в ионнуюжидкость С6MImNTf2 с добавкой 18-краун-6В пробирки типа Эппендорф вносили 25 мкл стандартных раствороваминокислот, 25 мкл 1 М раствора HCl, 50, 100, 250 и 500 мкл 0.1 М растворакраун-эфира 18-К-6, доводили объем раствора до 1 мл дистиллированной водой.Затем добавляли 250 мкл ионной жидкости С6MImNTf2 и ставили на 1 час вшейкер при температуре 30 0С (табл.

7).Таблица 7. Степени извлечения (%) аминокислот (25 мкг/мл) из водной фазы вионную жидкость С6MImNTf2 в зависимости от концентрации 18-краун-6 вводной фазе (n=3, p=0.95).Аминокислота3,4-ДигидроксифенилаланинТирозинТриптофан012±220±243±4Концентрация 18-краун-6, мМ5102585±988±991±580±897±299±197±398±299±15099±199±199±167II.3.1.3. Жидкостно-жидкостная экстракция аминокислот в ионнуюжидкость С6MImNTf2 при различном рН водной фазыВ пробирки типа Эппендорф вносили 25 мкл стандартных раствороваминокислот, 900 мкл дистиллированной воды.